腸外致病性大腸桿菌(Extraintestinal pathogenic coli,ExPEC)是近年來學術(shù)界和臨床上廣泛報道和關(guān)注的一類人獸共患性大腸桿菌,該菌可廣泛定殖于多種宿主的腸道外組織并引發(fā)嚴重的感染發(fā)病。其中,由該菌感染導(dǎo)致的細菌性腦膜炎一直以來對于人類健康和畜禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展都是一個巨大的挑戰(zhàn)。ExPEC侵入宿主的血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)是其引發(fā)腦膜炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟,需要特定的信號分子參與其中。以往的研究表明,ExPEC的多種菌體組分在細菌侵入宿主細胞進而穿過BBB的過程中以及在對抗機體免疫清除上發(fā)揮了重要作用。除了 ExPEC本身毒力因子的參與外,研究還報道宿主細胞的一些蛋白也參與到ExPEC的感染及其侵入BBB的過程,但其參與感染與致病的具體機制仍不十分清楚。在此,我們采用同位素標記相對和絕對定量技術(shù)(Isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)并結(jié)合LC-MS/MS,鑒定并分析豬源致腦膜炎E.coli菌株P(guān)CN033、人源致腦膜炎E coli菌株RS218以及非致腦膜炎E.coli菌株HB101分別感染腦微血管內(nèi)皮細胞(Brain microvascular endothelial cells,BMECs)時的差異表達蛋白,并通過差異表達蛋白的比較分析和進一步功能驗證,挖掘ExPEC感染過程中的重要宿主靶點,探討ExPEC感染導(dǎo)致腦膜炎的分子機制。本研究中,我們共鑒定到近3000種不同蛋白,比較不同感染組中的差異蛋白發(fā)現(xiàn)豬源ExPEC菌株P(guān)CN033感染細胞后出現(xiàn)的差異蛋白數(shù)量最多,有78種;人源致腦膜炎菌株RS218感染組出現(xiàn)差異蛋白43種;而非致腦膜炎層coli菌株HB101感染組最少,只有6種。分析發(fā)現(xiàn),僅在兩株強毒株感染后共同顯著變化的蛋白共12個,分別為TEL02、IFT74、CBWD6、TBPL1、RBM5、KRT9、HIST1H1C、HIST1H1D、HIST1H1B、HIST1H1E、MIF 和 DMD。提示,這些蛋白可能參與致腦膜炎E coli的感染與入侵過程。進一步的研究發(fā)現(xiàn),MIF是唯一在兩株致腦膜炎,E.coli感染條件下均發(fā)生顯著上調(diào)的蛋白,它能促進腦膜炎E.coli感染BMECs中細胞因子的產(chǎn)生,參與了腦膜炎E.coli感染BMECs中BBB的破壞。通過IPA網(wǎng)絡(luò)分析,我們還發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路和MAPK信號通路均參與了細胞應(yīng)對致腦膜炎強毒株的感染,兩者共同介導(dǎo)了 ExPEC感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。這些差異蛋白的鑒定和信號通路的解析為我們進一步了解致腦膜炎E.coli感染入侵宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)的過程和機制奠定了基礎(chǔ)。
【學位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R742.9
【部分圖文】：

圖１－１血腦屏障示意圖（Ｋｉｍ?２００８）??Ｆｉｇｕｒｅ?Ｍ?Ｔｈｅ?ｂｌｏｏｄ—ｂｒａｉｎ?ｂａｒｒｉｅｒ??

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相對或絕對定量的分析技術(shù)。ｉＴＲＡＱ試劑分為４標和８標試劑，本研宄采用的??是８標ｍｉＡＱ試劑，能對８種樣品進行標記，然后對混合標記后的蛋白樣品通??過一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜串聯(lián)質(zhì)譜方法進行分析（如圖１－３）。ｉＴＲＡＱ試劑包括??三個基團：一端是報告基團（ＲｅｐｏｒｔＧｒｏｕｐ），其質(zhì)量從１１３－１２１?（１２０除外，因為??１２０和苯丙氨酸的亞胺離子質(zhì)量一樣）；另外一端是反應(yīng)基團（Ｐｅｐｔｉｄｅ?Ｒｅａｃｔｉｖｅ??Ｇｒｏｕｐ），將報告基團與肽Ｎ端及賴氨酸側(cè)鏈連接；中間是平衡基團（Ｂａｌａｎｃｅ??Ｇｒｏｕｐ），起平衡報告基團質(zhì)量差的作用（王國佐ｅｔａｌ?２０１７）。??標記??消化；龜■?Ｚ混合二＾丨－級質(zhì)請??提取僅白?｜??二級質(zhì)ｉ著??４??．．．ＢＳＩ?Ｂ３?Ｄ?Ｋ２Ｓ?Ｂｌ?Ｂ９??ｍ?＊？？??，？?ｗ局部放大??｜?ｌ?—匕息?＾?ｌ－．?ｉｌ?Ｍ?－?？?Ｋ?—＾ｉｌｌ?ｔｌＬｌｌ．ｌ－ｉｌ．ｆＴｉ．ｉｌ?ｉｔｔｉ．－?７??圖１－３：?ｉＴＲＡＱ實驗流程??Ｆｉｇｕｒｅ?１?－３?Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆ?ｉＴＲＡＱ??鑒于ｉＴＲＡＱ比以前的方法更可靠更準確，己經(jīng)被廣泛用于各類生物學研宄??中。近些年來
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本文編號：2847939