朊病毒(Prion Disease,PrD),又稱為可傳播性海綿狀腦病(Transmissible Spongiform Encephalopathy,TSE),是一種侵襲人類及其他哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)的傳染性、神經(jīng)退行性疾病,具有潛伏期長和100%致死率的特點。目前人類朊病毒病主要分為:克-雅病(Creutzefeldt-Jakob Disease,CJD)、庫魯病(Kuru)、吉斯特曼-施特勞斯綜合癥(Gerstmann-Straüssler-Scheinker syndrome,GSS)和致死性家族型失眠癥(Fatal Familial Insomnia,FFI),以CJD最為常見。CJD又可分為散發(fā)型(sCJD)、醫(yī)源型(iCJD)、家族或遺傳型(fCJD or gCJD)及變異型克-雅病(vCJD)。目前臨床檢測方法有對患者腦組織進行活檢,通過檢測血液中PRNP基因突變情況判斷遺傳型克-雅病,以及檢測sCJD患者腦脊液中14-3-3蛋白含量的升高來輔助疾病的診斷。腦組織活檢對病人身體損傷極大,根據(jù)血液中PRNP基因是否突變只可判斷遺傳型克-雅病,存在很大局限性,而腦脊液中14-3-3蛋白的檢測則特異性不強。因此,臨床急需有效的朊病毒病診斷方法。微管由微管蛋白和微管相關蛋白(tau蛋白)組成,其中tau蛋白是含量最高的微管相關蛋白,微管系統(tǒng)是神經(jīng)細胞骨架成分,可參與多種細胞功能。研究證明,tau蛋白與多種神經(jīng)性疾病存在緊密聯(lián)系,并在朊病毒病患者及嚙齒動物模型腦組織中明顯升高,其中含外顯子2(tau-exon 2)和外顯子10(tau-exon 10)的特異型tau蛋白占總tau蛋白含量的大部分,因此本研究建立tau蛋白ELISA方法并應用于不同類型的朊病毒病患者腦脊液中。在本研究中,用含有pGEX-2T-E2和pGEX-2T-E10質(zhì)粒的原核菌體表達出目的蛋白GST tau-exon 2/10,測定目的蛋白濃度,GST tau-exon 2蛋白濃度為0.166μg/uL,GST tau-exon 10蛋白濃度為0.473μg/μL,制備單克隆抗體。制備完成的GST tau-exon 2蛋白單克隆抗體編號為1-4(1.8 mg/mL),4-1(1.7 mg/mL),GST tau-exon 10蛋白單克隆抗體編號為6-4(2.6 mg/mL),5-6(1.8 mg/mL)。用已制備的小鼠單克隆抗體使用蛋白免疫印跡方法分別檢測GST tau-exon 2/10蛋白,證明所制備抗體特異性,使用蛋白免疫印跡方法在神經(jīng)細胞模型和小鼠腦組織分別檢測tau蛋白證明抗體敏感性。使用已制備的抗體建立更強敏感性的雙抗夾心ELISA方法,最終GST tau-exon 2/10蛋白特異性單克隆抗體雙抗夾心ELISA方法的條件確定如下:包被抗體H-150濃度為8μg/ml,檢測抗體GST tau-exon 2(1-4)蛋白鼠源單克隆抗體、GST tau-exon 2(4-1)蛋白鼠源單克隆抗體、GST tau-exon 10(6-4)蛋白鼠源單克隆抗體、GST tau-exon 10(5-6)蛋白鼠源單克隆抗體的工作濃度分別選定為1μg/mL,1μg/mL,0.8μg/mL,1μg/mL。辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗稀釋比例為1:5,000。應用已建立好的雙抗夾心ELISA法對包括sCJD、GSS、FFI、T188K位點突變的gCJD及非CJD患者腦脊液中tau-exon 2/10蛋白含量進行檢測,結(jié)果顯示sCJD患者腦脊液中含外顯子2的tau蛋白相比于非CJD患者明顯升高,具有極顯著統(tǒng)計學差異(p0.001),sCJD患者腦脊液中含外顯子10的tau蛋白相比于非CJD患者明顯升高,具有顯著統(tǒng)計學差異(p0.01)。T188K位點突變的gCJD患者腦脊液中tau-exon 2/10蛋白含量相對于非CJD患者明顯增高,具有顯著統(tǒng)計學差異(p0.01)。而GSS和FFI患者腦脊液中tau-exon 2/10蛋白含量相對于非CJD患者無明顯差異,無統(tǒng)計學差異(NS)。本研究建立的特異性tau蛋白雙抗夾心ELISA方法可以有效的檢測出不同類型朊病毒患者腦脊液中tau-exon 2/10蛋白含量的水平變化,為朊病毒病的檢測提供有效的檢驗方法并對朊病毒病的機制研究提供理論依據(jù)。
【學位單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R742.9
【部分圖文】：

為變異型 CJD（new variant CJD，簡稱為 vCJD）。所爆發(fā)的瘋牛了世界范圍內(nèi)極大的社會恐慌并對全球造成了巨大的經(jīng)濟損失，并公共衛(wèi)生問題，這使得對朊病毒的研究不僅具有重大的科學意義價值。止，還沒有有效治愈朊病毒病的方法[16]。對于一般疾病來說，早大大提高治愈的幾率[17]。然而朊病毒病的診斷只有根據(jù)臨床體征準[18]，這通常在朊病毒病發(fā)病后期，此時患者腦組織已造成不可對中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）發(fā)生侵襲，分布在神經(jīng)細胞的表面上, PrPC）極易與其發(fā)生接觸并且產(chǎn)生相互作用，這會使得正常細胞變化[20]，該反應使神經(jīng)中朊病毒的復制加快，同時在神經(jīng)細胞中極易使得細胞發(fā)生損傷及凋亡，并且最終導致了神經(jīng)元丟失、腦性、膠質(zhì)細胞增生、病毒樣朊蛋白沉積的四種典型神經(jīng)病理變化[21

毒（scrapie fibre-like prion, PrPSc）作為所有朊病毒病的病原，自從 20代發(fā)現(xiàn)此種病毒以來，其與眾不同的復制方式及生理學特性使科學家始終占據(jù)著生命科學理論研究的焦點，并且分別有兩位研究朊病毒的0 年代和 90 年代獲得了至高無上的榮譽——諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。病毒皆不相同，它做為一種不包含核酸但是卻可以發(fā)揮自我復制的功感染性和極高致死率的蛋白粒子—朊病毒（PrPSc）[12]，此前的研究發(fā)是由于在正常細胞里的朊蛋白（PrPC）和具有感染性的蛋白粒子（PrP用，使得正常朊蛋白結(jié)構(gòu)或蛋白空間構(gòu)象發(fā)生變化而來[22]，換句話說和朊病毒同樣的一級結(jié)構(gòu)，即相同的氨基酸序列，正常朊蛋白與朊病為在 PrPC的二級結(jié)構(gòu)里面包括更多的α螺旋，而 PrPSc則包括大量的β折白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化隨之蛋白的物理化學特性和分子的生物學特性也由在去污劑中可溶變成在去污劑中不可溶，由不可抵抗蛋白酶的消化的消化產(chǎn)生抵抗[25, 26]。

小大約為 35KDa，在朊蛋白的內(nèi)部可以分為不同的結(jié)構(gòu)區(qū)域，其中包含一個 N-端信結(jié)構(gòu)區(qū)域、五個大量富含脯氨酸-甘氨酸的八肽重復序列區(qū)域、一個高度保守的中間區(qū)和一個與 GPI 錨相關的 C-端疏水區(qū)[28]。在一般情況下，PrPC由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)首先合，之后通過高爾基小體，最后定位在細胞膜的表面上[29]。因為 PrP 包含有兩個不同的化位點，所有在哺乳動物的細胞中，PrP 蛋白共包括三種不同的存在形式——無糖基型、單糖基化型或者雙糖基化型。細胞中的朊蛋白都是經(jīng)由 PRNP 基因所進行編碼PRNP 基因是 PRN 基因家族中的一員[30]。該基因家族中還包括有編碼 doppel 蛋白的ND 基因和編碼 shadoo 蛋白的 SPRN 基因[31, 32]。盡管 PRNP 基因由 2 到 3 個外顯子組但所有物種的 PRNP 基因開放閱讀框均由一個外顯子進行編碼[33]。如果向受體顱中種來源于其他種屬的朊病毒，因為受體的內(nèi)源性 PrPC基因序列較之外源宿主不同的Sc序列，朊病毒病的潛伏期在被接種受體中會明顯增加，并且在這些受體中一般情況不會如期地表現(xiàn)出朊病毒病的四種臨床病理特征。此種現(xiàn)象學術上稱為朊病毒進行感種屬屏障。
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本文編號：2844964