朊病毒(Prion Disease,PrD),又稱為可傳播性海綿狀腦病(Transmissible Spongiform Encephalopathy,TSE),是一種侵襲人類及其他哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)的傳染性、神經(jīng)退行性疾病,具有潛伏期長和100%致死率的特點(diǎn)。目前人類朊病毒病主要分為:克-雅病(Creutzefeldt-Jakob Disease,CJD)、庫魯病(Kuru)、吉斯特曼-施特勞斯綜合癥(Gerstmann-Straüssler-Scheinker syndrome,GSS)和致死性家族型失眠癥(Fatal Familial Insomnia,FFI),以CJD最為常見。CJD又可分為散發(fā)型(sCJD)、醫(yī)源型(iCJD)、家族或遺傳型(fCJD or gCJD)及變異型克-雅病(vCJD)。目前臨床檢測(cè)方法有對(duì)患者腦組織進(jìn)行活檢,通過檢測(cè)血液中PRNP基因突變情況判斷遺傳型克-雅病,以及檢測(cè)sCJD患者腦脊液中14-3-3蛋白含量的升高來輔助疾病的診斷。腦組織活檢對(duì)病人身體損傷極大,根據(jù)血液中PRNP基因是否突變只可判斷遺傳型克-雅病,存在很大局限性,而腦脊液中14-3-3蛋白的檢測(cè)則特異性不強(qiáng)。因此,臨床急需有效的朊病毒病診斷方法。微管由微管蛋白和微管相關(guān)蛋白(tau蛋白)組成,其中tau蛋白是含量最高的微管相關(guān)蛋白,微管系統(tǒng)是神經(jīng)細(xì)胞骨架成分,可參與多種細(xì)胞功能。研究證明,tau蛋白與多種神經(jīng)性疾病存在緊密聯(lián)系,并在朊病毒病患者及嚙齒動(dòng)物模型腦組織中明顯升高,其中含外顯子2(tau-exon 2)和外顯子10(tau-exon 10)的特異型tau蛋白占總tau蛋白含量的大部分,因此本研究建立tau蛋白ELISA方法并應(yīng)用于不同類型的朊病毒病患者腦脊液中。在本研究中,用含有pGEX-2T-E2和pGEX-2T-E10質(zhì)粒的原核菌體表達(dá)出目的蛋白GST tau-exon 2/10,測(cè)定目的蛋白濃度,GST tau-exon 2蛋白濃度為0.166μg/uL,GST tau-exon 10蛋白濃度為0.473μg/μL,制備單克隆抗體。制備完成的GST tau-exon 2蛋白單克隆抗體編號(hào)為1-4(1.8 mg/mL),4-1(1.7 mg/mL),GST tau-exon 10蛋白單克隆抗體編號(hào)為6-4(2.6 mg/mL),5-6(1.8 mg/mL)。用已制備的小鼠單克隆抗體使用蛋白免疫印跡方法分別檢測(cè)GST tau-exon 2/10蛋白,證明所制備抗體特異性,使用蛋白免疫印跡方法在神經(jīng)細(xì)胞模型和小鼠腦組織分別檢測(cè)tau蛋白證明抗體敏感性。使用已制備的抗體建立更強(qiáng)敏感性的雙抗夾心ELISA方法,最終GST tau-exon 2/10蛋白特異性單克隆抗體雙抗夾心ELISA方法的條件確定如下:包被抗體H-150濃度為8μg/ml,檢測(cè)抗體GST tau-exon 2(1-4)蛋白鼠源單克隆抗體、GST tau-exon 2(4-1)蛋白鼠源單克隆抗體、GST tau-exon 10(6-4)蛋白鼠源單克隆抗體、GST tau-exon 10(5-6)蛋白鼠源單克隆抗體的工作濃度分別選定為1μg/mL,1μg/mL,0.8μg/mL,1μg/mL。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗稀釋比例為1:5,000。應(yīng)用已建立好的雙抗夾心ELISA法對(duì)包括sCJD、GSS、FFI、T188K位點(diǎn)突變的gCJD及非CJD患者腦脊液中tau-exon 2/10蛋白含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示sCJD患者腦脊液中含外顯子2的tau蛋白相比于非CJD患者明顯升高,具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.001),sCJD患者腦脊液中含外顯子10的tau蛋白相比于非CJD患者明顯升高,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01)。T188K位點(diǎn)突變的gCJD患者腦脊液中tau-exon 2/10蛋白含量相對(duì)于非CJD患者明顯增高,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01)。而GSS和FFI患者腦脊液中tau-exon 2/10蛋白含量相對(duì)于非CJD患者無明顯差異,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(NS)。本研究建立的特異性tau蛋白雙抗夾心ELISA方法可以有效的檢測(cè)出不同類型朊病毒患者腦脊液中tau-exon 2/10蛋白含量的水平變化,為朊病毒病的檢測(cè)提供有效的檢驗(yàn)方法并對(duì)朊病毒病的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R742.9
【部分圖文】：

為變異型 CJD（new variant CJD，簡稱為 vCJD）。所爆發(fā)的瘋牛了世界范圍內(nèi)極大的社會(huì)恐慌并對(duì)全球造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并公共衛(wèi)生問題，這使得對(duì)朊病毒的研究不僅具有重大的科學(xué)意義價(jià)值。止，還沒有有效治愈朊病毒病的方法[16]。對(duì)于一般疾病來說，早大大提高治愈的幾率[17]。然而朊病毒病的診斷只有根據(jù)臨床體征準(zhǔn)[18]，這通常在朊病毒病發(fā)病后期，此時(shí)患者腦組織已造成不可對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）發(fā)生侵襲，分布在神經(jīng)細(xì)胞的表面上, PrPC）極易與其發(fā)生接觸并且產(chǎn)生相互作用，這會(huì)使得正常細(xì)胞變化[20]，該反應(yīng)使神經(jīng)中朊病毒的復(fù)制加快，同時(shí)在神經(jīng)細(xì)胞中極易使得細(xì)胞發(fā)生損傷及凋亡，并且最終導(dǎo)致了神經(jīng)元丟失、腦性、膠質(zhì)細(xì)胞增生、病毒樣朊蛋白沉積的四種典型神經(jīng)病理變化[21

毒（scrapie fibre-like prion, PrPSc）作為所有朊病毒病的病原，自從 20代發(fā)現(xiàn)此種病毒以來，其與眾不同的復(fù)制方式及生理學(xué)特性使科學(xué)家始終占據(jù)著生命科學(xué)理論研究的焦點(diǎn)，并且分別有兩位研究朊病毒的0 年代和 90 年代獲得了至高無上的榮譽(yù)——諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。病毒皆不相同，它做為一種不包含核酸但是卻可以發(fā)揮自我復(fù)制的功感染性和極高致死率的蛋白粒子—朊病毒（PrPSc）[12]，此前的研究發(fā)是由于在正常細(xì)胞里的朊蛋白（PrPC）和具有感染性的蛋白粒子（PrP用，使得正常朊蛋白結(jié)構(gòu)或蛋白空間構(gòu)象發(fā)生變化而來[22]，換句話說和朊病毒同樣的一級(jí)結(jié)構(gòu)，即相同的氨基酸序列，正常朊蛋白與朊病為在 PrPC的二級(jí)結(jié)構(gòu)里面包括更多的α螺旋，而 PrPSc則包括大量的β折白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化隨之蛋白的物理化學(xué)特性和分子的生物學(xué)特性也由在去污劑中可溶變成在去污劑中不可溶，由不可抵抗蛋白酶的消化的消化產(chǎn)生抵抗[25, 26]。

小大約為 35KDa，在朊蛋白的內(nèi)部可以分為不同的結(jié)構(gòu)區(qū)域，其中包含一個(gè) N-端信結(jié)構(gòu)區(qū)域、五個(gè)大量富含脯氨酸-甘氨酸的八肽重復(fù)序列區(qū)域、一個(gè)高度保守的中間區(qū)和一個(gè)與 GPI 錨相關(guān)的 C-端疏水區(qū)[28]。在一般情況下，PrPC由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)首先合，之后通過高爾基小體，最后定位在細(xì)胞膜的表面上[29]。因?yàn)?PrP 包含有兩個(gè)不同的化位點(diǎn)，所有在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中，PrP 蛋白共包括三種不同的存在形式——無糖基型、單糖基化型或者雙糖基化型。細(xì)胞中的朊蛋白都是經(jīng)由 PRNP 基因所進(jìn)行編碼PRNP 基因是 PRN 基因家族中的一員[30]。該基因家族中還包括有編碼 doppel 蛋白的ND 基因和編碼 shadoo 蛋白的 SPRN 基因[31, 32]。盡管 PRNP 基因由 2 到 3 個(gè)外顯子組但所有物種的 PRNP 基因開放閱讀框均由一個(gè)外顯子進(jìn)行編碼[33]。如果向受體顱中種來源于其他種屬的朊病毒，因?yàn)槭荏w的內(nèi)源性 PrPC基因序列較之外源宿主不同的Sc序列，朊病毒病的潛伏期在被接種受體中會(huì)明顯增加，并且在這些受體中一般情況不會(huì)如期地表現(xiàn)出朊病毒病的四種臨床病理特征。此種現(xiàn)象學(xué)術(shù)上稱為朊病毒進(jìn)行感種屬屏障。
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本文編號(hào)：2844964