肌原纖維肌病(Myofibrillarmyopathies,MFMs)是一組臨床表型復(fù)雜,具有豐富臨床異質(zhì)性與遺傳異質(zhì)性的疾病。該組肌病具有相似的病理表現(xiàn),即:與肌原纖維相關(guān)的蛋白異常沉積,目前發(fā)現(xiàn)的致病基因有DES、CRYAB、MYOT、LDB3、FLNC、BAG3、FHL1、TTN、DNAJB6、PLEC、HSPB8A、ACTA1、MYH7等。其致病基因與先天性肌病、肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良以及心肌病等存在重疊,提示其具有廣泛的臨床/遺傳異質(zhì)性,其致病機(jī)制多與肌原纖維相關(guān)蛋白、Z線相關(guān)蛋白等結(jié)構(gòu)或功能異常相關(guān)導(dǎo)致肌纖維收縮異常而致病。該組肌病臨床表現(xiàn)從遠(yuǎn)端型肌病、肢帶型肌無力綜合征、先天性肌病等特征性肌群受累,到肩腓綜合征、足下垂、中軸肌受累、不對(duì)稱性肢體無力等非對(duì)稱性肌病等,臨床表型包括多種形式的肌病特點(diǎn)。血肌酸激酶多輕度升高或正常。肌電圖可出現(xiàn)肌源性、神經(jīng)源性、肌源性合并神經(jīng)源性等多種異常表現(xiàn)。MFMs的肌肉病理診斷主要依賴光學(xué)顯微鏡。典型的光鏡病理表現(xiàn)包括:HE染色可見嗜酸性小體或嗜酸性物質(zhì);MGT染色示不定形或顆粒狀的異染物質(zhì)、鑲邊或非鑲邊空泡;在異常肌原纖維區(qū)域(特別是有嗜酸性小體區(qū)域),可見氧化酶活性局部減弱或缺失:擦涂纖維、漩渦纖維;可同時(shí)存在角化肌纖維及肌纖維群化等神經(jīng)源性改變等。相似的病理表現(xiàn)其致病基因各異,以及復(fù)雜的臨床表型都為肌原纖維肌病的診斷帶來了不小的挑戰(zhàn),診斷必須基于致病基因分析;使用傳統(tǒng)Sanger法基因分析在診斷陽性率、分型診斷、鑒別診斷、及時(shí)效方面均存在不同的局限性,目的基因捕獲二代測(cè)序(Next generation sequencing,NGS)技術(shù),能夠?qū)Χ鄠�(gè)基因的全部外顯子一次性捕獲、測(cè)序,達(dá)到99%堿基覆蓋度,對(duì)每一個(gè)堿基檢測(cè)平均測(cè)序深度達(dá)100重以上,快速、準(zhǔn)確、一次性完成多個(gè)目的基因的外顯子測(cè)序,其所用時(shí)間少、單堿基測(cè)序費(fèi)用低及生物信息分析相對(duì)簡(jiǎn)單,因此更多應(yīng)用于臨床。彌補(bǔ)了Sanger測(cè)序在分子生物學(xué)診斷中的不足。本研究從河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院活檢骨骼肌遺傳資源標(biāo)本庫(2005.3-2017.2,1598例)篩選:1)肌原纖維肌病(9例);2)無特殊病理改變的其他類型先天性肌病(9例);3)免疫組化染色陰性的肢帶綜合征12例進(jìn)行臨床、病理分析,目的基因捕獲二代測(cè)序進(jìn)行致病基因篩查,生物信息學(xué)分析得出的位點(diǎn)經(jīng)患者及可獲得的親屬Sanger法驗(yàn)證。第一部分肌原纖維肌病臨床、病理及分子生物學(xué)研究目的:通過骨骼肌病理活檢疑診肌原纖維肌病的9例患者,通過目的基因捕獲二代測(cè)序進(jìn)行分子生物學(xué)研究,分析其可能的致病基因,以期總結(jié)臨床表型、病理表現(xiàn)與致病基因有無相關(guān)性,探討NGS在肌原纖維肌病中的診斷價(jià)值。方法:1.篩選入組患者臨床、病理資料:1)臨床表現(xiàn):符合肌病的臨床特點(diǎn),緩慢進(jìn)展加重的對(duì)稱/不對(duì)稱的四肢遠(yuǎn)端/近端肌無力、肌萎縮;2)肌酸激酶正�；蜉p度升高;肌電圖肌源性和/或神經(jīng)源性損害;3)活檢骨骼肌組織化學(xué)染色可見肌細(xì)胞肌膜下胞漿中異常沉積物,在異常肌原纖維區(qū)域(特別是有嗜酸性小體區(qū)域),可見氧化酶活性局部減弱或缺失;2.收集患者臨床資料,包括性別、起病年齡、就診年齡、臨床肌力評(píng)定、血清肌酸激酶結(jié)果、肌電圖及神經(jīng)電圖結(jié)果、雙下肢骨骼肌核磁結(jié)果、心肌核素顯像結(jié)果等;3.活檢骨骼肌組織化學(xué)染色病理分析,包括光鏡與電鏡;4.目的基因捕獲二代測(cè)序,分子生物學(xué)分析可能的致病突變,Sanger測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果:1.臨床資料:9例患者男性6例,女性3例,臨床表現(xiàn)以遠(yuǎn)端肌無力起病4例,肢帶肌無力起病5例;血清肌酸激酶升高6例,正常3例;肌電圖檢查單純肌源性異常5例,合并肌源性合并神經(jīng)源性異常3例,單純神經(jīng)源性異常1例。5例患者行心肌核素顯像檢查,其中正常3例,異常2例;7例行雙下肢骨骼肌MRI檢查者均有不同肌群脂肪沉積,均符合肌病影像表現(xiàn)。2.活檢骨骼肌病理分析:9例患者均呈現(xiàn)肌病的病理表現(xiàn),肌纖維直徑大小不一,可見變性肌纖維,壞死與再生肌纖維少見。結(jié)締組織輕度或輕中度增生,胞漿內(nèi)肌膜下可見顆粒狀、絲狀、串珠狀等異常物質(zhì)沉積,NADH、SDH、COX酶染色可見肌原纖維網(wǎng)紊亂。3.目的基因捕獲二代測(cè)序及分子生物學(xué)分析:9例患者中有4例未發(fā)現(xiàn)肌原纖維肌病相關(guān)基因致病突變;發(fā)現(xiàn)TTN錯(cuò)義突變(c.90211TC,Cys30071Arg)1例,DES錯(cuò)義突變(c.1255CT,Pro419Ser)1例,MYH7新發(fā)剪切突變(c.3337-2-C,splicing)1例;PLEC新發(fā)復(fù)合雜合突變(c.13001GA,p.R4334H;c.10879GA,p.D3627N)1例,MYH7已報(bào)致病突變(c.5533CT,p.R1845W)1例。結(jié)論:1.肌原纖維肌病包括遠(yuǎn)端型肌病、肢帶綜合征、不對(duì)稱肌群受累等臨床表型,沒有固定的起病形式與肌群受累模式,臨床表現(xiàn)沒有特異性。但不對(duì)稱肌無力在臨床表現(xiàn)中相對(duì)特異,早期即可合并心肌病、呼吸肌受累。2.骨骼肌活檢具有特征性的病理表現(xiàn),即胞漿內(nèi)異常物質(zhì)沉積,單克隆免疫組織化學(xué)染色相關(guān)蛋白深染對(duì)疾病診斷具有指向性。3.肌原纖維病致病基因與先天性肌病致病基因部分重疊。4.致病基因復(fù)雜,部分臨床和肌肉病理符合MFMs表現(xiàn)的患者未發(fā)現(xiàn)其致病基因,故基因檢測(cè)陰性的患者不能排除MFMs診斷。5.二代測(cè)序有助于該組肌病的分子生物學(xué)診斷,提高對(duì)胞漿內(nèi)異常沉積性疾病的認(rèn)識(shí),擴(kuò)大疾病譜系,豐富致病基因的臨床內(nèi)表型與臨床外表型。第二部分非典型“先天性肌病”臨床、病理及分子生物學(xué)研究目的:先天性肌病(Congenital myopathies,CMs)是一組單基因遺傳骨骼肌疾病,具有臨床及遺傳異質(zhì)性,活檢骨骼肌病理存在特定的結(jié)構(gòu)改變。但骨骼肌活檢無特殊病理改變的先天性肌病患兒其診斷及鑒別診斷相對(duì)復(fù)雜,單純病理改變無法為分子生物學(xué)診斷提供方向。本研究對(duì)臨床、骨骼肌病理篩選出不典型先天性肌病患者9例,經(jīng)二代測(cè)序致病基因分析進(jìn)行分子生物學(xué)研究,篩查非典型先天性肌病致病基因,探討肌原纖維病與先天性肌病重疊譜系疾病的臨床表型、及遺傳異質(zhì)性研究,探討二代測(cè)序在復(fù)雜的肌原纖維病與先天性肌病重疊譜系中的應(yīng)用價(jià)值。方法:1.篩選入組患者臨床、病理資料:1)臨床表現(xiàn):符合先天性肌病的臨床特點(diǎn),自幼起病,生后運(yùn)動(dòng)能力發(fā)育遲緩,伴有/不伴有智能發(fā)育異常,肌電圖提示肌源性損害或神經(jīng)源性損害或肌源性合并神經(jīng)源性損害,血清肌酸激酶輕度升高或正常,骨骼肌活檢病理無典型先天性肌病病理像,可除外桿狀體肌病、中心核肌病、中央軸空病等特征性先天性肌病;2.收集患者臨床資料,包括性別、起病年齡、就診年齡、臨床肌力評(píng)定、血清肌酸激酶結(jié)果、肌電圖及神經(jīng)電圖結(jié)果、雙下肢骨骼肌核磁結(jié)果、心肌核素顯像結(jié)果等;3.活檢骨骼肌組織化學(xué)染色病理分析,包括光鏡與電鏡;4.目的基因捕獲二代測(cè)序,分子生物學(xué)分析可能的致病突變,Sanger測(cè)序驗(yàn)證。5.對(duì)部分基因檢測(cè)提示COLA6基因異�；颊咝袉慰寺】贵w抗COLA6免疫熒光染色。結(jié)果:1.臨床資料9例患者中1例女性,8例男性,均為自幼運(yùn)動(dòng)能力發(fā)育遲緩患兒,嚴(yán)重者不能行走,輕者可跑跳活動(dòng);5例患者存在關(guān)節(jié)攣縮,8例患者四肢遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)過伸展。2.實(shí)驗(yàn)室及輔助檢查:血清肌酸激酶波動(dòng)于86-1335U/L,6例患者表現(xiàn)為肌源性受累,1例為肌源性合并神經(jīng)源性改變,以肌源性改變?yōu)橹?2例以神經(jīng)源性改變?yōu)橹?5例行雙下肢骨骼肌MRI檢查者均有不同肌群脂肪沉積,無明顯特異性肌群受累。3.骨骼肌活檢病理分析:9例患者均為肌病表現(xiàn),輕重不一,其中5例患者存在明顯中心核現(xiàn)象,肌纖維6例患者結(jié)締組織中重度增生,6例患者行抗膠原Ⅵ、膠原Ⅳ單克隆抗體熒光免疫組化染色,提示肌纖維膜及結(jié)締組織內(nèi)膠原Ⅵ蛋白缺失或減少。4.目的基因捕獲分子生物學(xué)分析:在本組患者中,共發(fā)現(xiàn)5種基因異常,包括RYR1、LMNA、COL6A1、COL6A2、MYH7等,其中缺失突變2個(gè),剪切突變1個(gè),錯(cuò)義突變11個(gè),其中新發(fā)基因突變10個(gè);4例患者為已報(bào)致病突變。結(jié)論:1.兒童起病的遺傳性骨骼肌疾病,臨床表型相似:肌無力、肌萎縮、松軟兒綜合征、骨關(guān)節(jié)攣縮、畸形等,相同的臨床表現(xiàn)其致病基因多樣,骨骼肌活檢對(duì)疾病的診斷具有一定的指向作用,但骨骼肌病理無特異改變時(shí),需依賴分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步確診。2.先天性肌病與先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良臨床表現(xiàn)相似,與肌原纖維病臨床表型重疊。膠原Ⅵ蛋白相關(guān)肌病臨床表型包括Ullrich型先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良,中間型VI型膠原蛋白病和Bethlem肌病,其中中間型可表現(xiàn)為先天性肌病,臨床難以鑒別。3.骨骼肌活檢未發(fā)現(xiàn)特征性病理改變的不能除外先天性肌病/先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良,以及肌原纖維病。4.二代測(cè)序技術(shù)對(duì)于非典型先天性肌病/肌營(yíng)養(yǎng)不良、肌原纖維病重疊譜系的診斷提供了方法學(xué)依據(jù)。5.致病基因分析必要時(shí)需結(jié)合蛋白表達(dá),以明確診斷。6.全基因組測(cè)序可能幫助臨床醫(yī)生認(rèn)識(shí)新的疾病譜系。第三部分二代測(cè)序技術(shù)在肢帶綜合征的診斷價(jià)值目的:多種不同的肌病可導(dǎo)致肢帶綜合征即四肢近段肌、腰帶肌無力、萎縮的表現(xiàn),常見的有肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良、先天性肌病、肌原纖維病等,其中肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良具有豐富的遺傳異質(zhì)性,單純病理改變無法為分子生物學(xué)診斷提供方向。本研究對(duì)臨床、骨骼肌病理篩選出肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良患者12例,經(jīng)二代測(cè)序致病基因分析進(jìn)行分子生物學(xué)研究,總結(jié)臨床/病理特點(diǎn)。方法:1.篩選經(jīng)臨床、活檢骨骼肌病理診斷肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良患者12例。入選標(biāo)準(zhǔn):1)臨床表現(xiàn):符合肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良的臨床特點(diǎn),青中年起病的四肢近端肌無力、肌萎縮,緩慢進(jìn)行性加重,肌電圖提示肌源性損害,血清肌酸激酶值顯著升高,骨骼肌活檢病理提示肌營(yíng)養(yǎng)不良病理改變,同時(shí)單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色抗Dystrophin、抗Dysferlin、抗Sacoglycan等蛋白染色均正常。2.收集患者臨床資料,包括性別、起病年齡、就診年齡、臨床肌力評(píng)定、血清肌酸激酶結(jié)果、肌電圖及神經(jīng)電圖結(jié)果、雙下肢骨骼肌核磁結(jié)果、心肌核素顯像結(jié)果等;3.活檢骨骼肌組織化學(xué)染色病理分析,包括光鏡與電鏡;4.目的基因捕獲二代測(cè)序,分子生物學(xué)分析可能的致病突變,Sanger測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果:1.臨床資料:12例患者中6例男性,6例女性,均以四肢近段肌、腰帶肌無力為主要表現(xiàn),4例伴有頸肌無力。2例為妊娠后癥狀明顯加重。血清肌酸激酶均明顯升高,肌電圖檢查均提示肌源性改變,5例行心肌核素顯像4例提示心肌灌注異常表現(xiàn);8例雙下肢骨骼肌MRI提示不同程度脂肪浸潤(rùn)。2.活檢骨骼肌組織化學(xué)染色:所有患者均呈不同程度肌營(yíng)養(yǎng)不良病理改變,2例有大量典型分葉肌纖維。3.目的基因捕獲分子生物學(xué)分析:12例病人中共發(fā)現(xiàn)7種不同的基因突變:發(fā)現(xiàn)4例患者攜帶CAPN3突變,1例患者TCAP純合突變,1例POMT2復(fù)合雜合突變;1例FKRP復(fù)合雜合突變;1例PLEC復(fù)合雜合突變,1例GMPPB復(fù)合雜合突變,1例LAMA2復(fù)合雜合突變。結(jié)論:1.肢帶綜合征缺少特異性臨床表現(xiàn)時(shí)要高度關(guān)注骨骼肌MRI,由此發(fā)現(xiàn)臨床內(nèi)表型特點(diǎn)。2.二代測(cè)序可以較好得解決肢帶綜合征的分子生物學(xué)診斷。3.本研究提高了對(duì)LGMD2的認(rèn)識(shí),特別是對(duì)少見類型LGMD2的表型認(rèn)識(shí),以及對(duì)LGMD2遺傳異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R746
【部分圖文】：

本組病例組化染色圖

圖 2 部分患者電鏡結(jié)果Fig.2 Ultrastructure diagram of partial casesA: case 8, mitochondrial vacuolation, abnormal material deposition in thecytoplasm; B: case 6, Z line structure disorder, rod-shaped substancedeposition; C: case 7, mitochondrial vacuolation, intermuscular dysplasiaaccompanied by glycogen accumulation.

圖 3 部分患者雙下肢骨骼肌 MRIFig.3 MRI images of skeletal muscle of the lower extremities of the limbswith some casesA: case 1, T1, diffuse fat deposition on the thigh, and the middle muscle of thefemur was obviously affected; B: case 1, T1, diffuse fat infiltration of thelower leg, and the fibula muscle group was obviously affected;C: case 6, T1,bilateral thigh muscle tissue signal is basically normal; D: case 6, T1, fattyinfiltration of anterior tibial muscle of the calf;case 11, T1, heavy fat soaked inthe back of the thighs; F: case 11, T2, the muscle of the posterior group of thelower leg can be seen fatty infiltration, and the medial head of the gastroc-nemius is obviously affected.
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本文編號(hào)：2840872