目的:重癥肌無(wú)力(Myasthenia gravis,MG)是以神經(jīng)肌肉接頭傳導(dǎo)障礙為特征的慢性自身免疫性炎性疾病。大約85%的MG患者伴有針對(duì)突觸后膜乙酰膽堿受體(Acetylcholine receptor,ACh R)的自身抗體。T細(xì)胞、B細(xì)胞和細(xì)胞因子之間的相互作用在神經(jīng)肌肉接頭處的免疫炎性反應(yīng)中起著重要的作用。白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)-35是新發(fā)現(xiàn)的IL-12家族成員,通過(guò)抑制輔助性T細(xì)胞分化及炎癥因子的釋放,下調(diào)炎癥反應(yīng)。IL-35在MG中的作用尚不明確。本研究旨在通過(guò)血清水平、細(xì)胞水平、分子蛋白水平探索IL-35在MG中的作用。方法:第一部分:入組急性期MG患者41例,35名年齡性別相匹配的健康對(duì)照(Health control,HC)。采集患者的一般臨床資料、應(yīng)用美國(guó)重癥肌無(wú)力基金會(huì)(Myasthenia Gravis Foundation of America,MGFA)的分期標(biāo)準(zhǔn)明確治療后臨床狀態(tài),并應(yīng)用MG定量評(píng)分(Quantitative MG score,QMG)量表和MG日常生活(MG activities of daily living,MG-ADL)量表評(píng)分評(píng)估患者的臨床癥狀,通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)MG患者外周血IL-35的水平;流式細(xì)胞儀檢測(cè)MG患者T、B細(xì)胞亞群的變化;對(duì)其中24例治療后輕微癥狀(Mimal Manifestation,MM)-3期的MG患者,通過(guò)ELISA和流式細(xì)胞儀的方法比較治療前后MG患者外周血IL-35的表達(dá)水平及T、B細(xì)胞亞群的變化,從而明確IL-35在MG中表達(dá)情況及哪些T、B細(xì)胞亞群的失衡參與了MG的病情發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。第二部分:對(duì)入組的41例MG患者及35名HC,流式細(xì)胞儀分析分泌IL-35的T、B細(xì)胞的比例,并比較MG不同亞型間分泌IL-35的T、B細(xì)胞的比例情況。隨機(jī)選取8例未經(jīng)治療的MG患者及8名年齡性別匹配的HC,流式細(xì)胞儀分選出CD4+T細(xì)胞,給予MG組IL-35干預(yù),通過(guò)PCR及流式細(xì)胞儀檢測(cè)其是否可正反饋?zhàn)饔糜诜置贗L-35的T細(xì)胞。第三部分:對(duì)入組的MG患者中隨機(jī)選出6例未經(jīng)治療的MG患者,流式細(xì)胞儀分選出CD4+T細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),將其分為3組,分別為未干預(yù)組,促進(jìn)Th17細(xì)胞分化組,促分化+IL-35干預(yù)組,通過(guò)PCR及流式細(xì)胞儀的方法觀察IL-35對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響,并通過(guò)Western blot明確IL-35在MG中作用的信號(hào)通路,從而明確MG患者中IL-35對(duì)Th17細(xì)胞的影響及可能的機(jī)制。結(jié)果第一部分:1.未經(jīng)治療的MG患者外周血中IL-35的水平(1.94±1.78ng/m L)低于HC(4.53±3.35ng/m L)(p=0.040);其中全身型MG(Generalized MG,GMG)患者外周血IL-35的水平(1.04±1.15ng/m L)低于眼肌型MG(Ocular MG,OMG)(2.75±2.38ng/m L)(p=0.002);合并胸腺瘤的MG患者(0.61±0.41ng/m L)低于未合并者(2.11±2.01ng/m L)(p=0.023)。2.24例治療后MM-3期的MG患者外周血IL-35水平(5.17±2.71ng/m L)較治療前升高(1.19±1.09ng/m L)(p0.001)。3.未經(jīng)治療的MG患者CD19+IL-10+B細(xì)胞的比例低于HC(p=0.008);24例治療后MM-3期的MG患者CD19+IL-10+B細(xì)胞的比例較治療前升高(p0.001)。4.未經(jīng)治療的MG患者CD4+CD25+T的比例低于HC(p0.001);未經(jīng)治療的MG患者Th1和Th17細(xì)胞的比例高于HC(p=0.039;p0.001);24例治療后MM-3期的MG患者CD4+CD25+T細(xì)胞比例較治療前升高(p=0.013),而Th17細(xì)胞比例較治療前降低(p=0.006)。5.MG患者血清IL-35水平與臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析顯示:MG患者血清IL-35水平與QMG及MG-ADL評(píng)分成負(fù)相關(guān)(r=0.002,p=-0.465;r=-0.361,p=0.020)。IL-35水平與Th17細(xì)胞比例成負(fù)相關(guān)(r=-0.335,p=0.031),與CD19+IL-10+B細(xì)胞比例成正相關(guān)(r=0.372,p=0.017)。6.MG患者血清IL-17的水平(77.28±27.1 pg/m L)高于HC(42.57±13.49 pg/m L)(p0.001),且GMG患者血清IL-17水平(90.51±25.7 pg/m L)高于OMG患者(58.61±16.10 pg/m L)(p0.001),合并胸腺瘤者(100.48±22.54 pg/m L)高于未合并者(71.66±25.33 pg/m L)(p=0.005),治療后MM-3期的MG患者血清IL-17的水平較治療前降低(p=0.002)。且MG患者血清IL-35與IL-17成明顯的負(fù)相關(guān)(r=-0.514,p=0.001)。第二部分:1.未經(jīng)治療的MG患者中CD4+CD25+IL-35+的細(xì)胞比例低于HC(p0.001);且GMG低于OMG(p=0.003);合并胸腺瘤的比例低于未合并者(p=0.001);治療后MM-3期者比例較治療前升高(p0.001)。2.未經(jīng)治療的MG患者中CD19+IL-35+的細(xì)胞比例低于HC(p0.001)。其中GMG患者中CD19+IL-35+的細(xì)胞百分比低于OMG(p=0.001);合并胸腺瘤的比例低于未合并者(p=0.008);且治療后MM-3期MG患者較治療前升高(p=0.001)。3.IL-35干預(yù)后MG中EBI3和P35 m RNA的表達(dá)水平比未干預(yù)組及HC組高(p0.001,p0.001,p0.001,p0.001)。IL-35干預(yù)后MG中CD4+CD25+IL-35+T細(xì)胞的百分比較未干預(yù)組及HC組升高(p0.001,p=0.004)。第三部分:1.促分化組IL-17A及RORγt m RNA表達(dá)水平高于未干預(yù)組及IL-35干預(yù)組(p0.001,p=0.004,p0.001,p0.001)。IL-35干預(yù)組與未干預(yù)組之間的IL-17A及RORγt m RNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異(p=0.096,p=0.392)。2.促分化組CD4+IL-17A+T細(xì)胞的百分比高于未干預(yù)組及IL-35干預(yù)組(p0.001,p=0.001)。IL-35干預(yù)組與未干預(yù)組之間的CD4+IL-17A+T細(xì)胞的百分比之間無(wú)明顯差異(p=0.284)。3.在MG中IL-35可能通過(guò)激活STAT1的信號(hào)通路來(lái)抑制Th17細(xì)胞的分化,發(fā)揮免疫抑制作用。結(jié)論1.T、B細(xì)胞亞群的失衡在MG的病情發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用,尤其是T細(xì)胞亞群。IL-35可能在MG的病情轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用;IL-35急性期的降低可能與Treg和Breg細(xì)胞比例的降低有關(guān)。MG中IL-35可能通過(guò)調(diào)控Th17細(xì)胞來(lái)發(fā)揮免疫抑制作用。2.MG急性期分泌IL-35的T、B細(xì)胞的變化與細(xì)胞因子IL-35的變化一致,提示分泌IL-35的T、B細(xì)胞的失衡參與了MG病情的發(fā)展變化。IL-35可以通過(guò)正反饋?zhàn)饔糜贑D4+T細(xì)胞從而進(jìn)一步促進(jìn)IL-35的釋放而發(fā)揮免疫抑制功能。3.MG患者中IL-35可以抑制Th17細(xì)胞的分化,此過(guò)程可能是通過(guò)激活STAT1的信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R746.1
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明Ⅹ
前言
    研究現(xiàn)狀、成果
    研究目的、方法
一、外周血IL-35水平與MG不同疾病狀態(tài)及臨床特征的相關(guān)性
    1.1 對(duì)象和方法
        1.1.1 研究對(duì)象
        1.1.2 研究方法
        1.1.3 統(tǒng)計(jì)分析
    1.2 結(jié)果
        1.2.1 MG患者及HCs人口學(xué)、特征分析
        1.2.2 未經(jīng)治療的MG患者外周血IL-35的水平與HC的比較
        1.2.3 治療后MG患者外周血IL-35的水平與治療前的比較
        1.2.4 未經(jīng)治療的MG患者B細(xì)胞亞型與HC的比較
        1.2.5 治療前后MG患者B細(xì)胞亞型的變化
        1.2.6 未經(jīng)治療MG患者T細(xì)胞亞型與HC的比較
        1.2.7 治療前后MG患者T細(xì)胞亞型的變化
        1.2.8 MG患者血清IL-35與臨床資料及T、B細(xì)胞亞型的相關(guān)性
        1.2.9 MG患者血清IL-35與IL-17的相關(guān)性
    1.3 討論
    1.4 小結(jié)
二、T、B細(xì)胞IL-35表達(dá)水平與MG不同疾病狀態(tài)的相關(guān)性
    2.1 對(duì)象和方法
        2.1.1 研究對(duì)象
        2.1.2 研究方法
        2.1.3 統(tǒng)計(jì)分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 未經(jīng)治療的MG患者與HC分泌IL-35的T細(xì)胞的比較
        2.2.2 治療前后MG患者分泌IL-35的T細(xì)胞的比較
        2.2.3 未經(jīng)治療的MG患者與HC分泌IL-35的B細(xì)胞的比較
        2.2.4 治療前后MG患者分泌IL-35的B細(xì)胞的比較
        2.2.5IL-35能正反饋?zhàn)饔糜赥細(xì)胞進(jìn)一步分泌IL-35
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
三、IL-35對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響
    3.1 對(duì)象和方法
        3.1.1 研究對(duì)象
        3.1.2 研究方法
        3.1.3 統(tǒng)計(jì)分析
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 三組間IL-17AmRNA的表達(dá)情況
        3.2.2 三組間Th17細(xì)胞的比例情況
        3.2.3 Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
全文結(jié)論
論文創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明
附錄
綜述 白細(xì)胞介素12家族細(xì)胞因子在神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病中的作用
    綜述參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷

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