研究背景及目的膠質瘤是成人原發(fā)性惡性腦腫瘤中最常見的類型,占所有原發(fā)性腦腫瘤和其他中樞神經系統(tǒng)腫瘤的28%。由于膠質瘤細胞的彌漫性浸潤和對放化療的抵抗性,將其歸為致死性腫瘤。大約56.6%的膠質瘤患者為IV級星形細胞瘤,稱為膠質母細胞瘤(Glioblastoma,GBM),這是一種高度侵襲性的腫瘤。GBM患者預后不佳,中位生存期僅為12-15個月。目前,GBM的主要治療方法有手術治療、放射療法和化學療法,雖然隨著醫(yī)療技術的進步,GBM的治療取得了一定的成果,但由于其高侵襲性、腫瘤細胞生長機制和發(fā)展的不明確性以及血腦屏障的存在,GBM的治療仍然是一大難題。炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在著重要的聯(lián)系。它與腫瘤發(fā)生的各個階段都有相關性,如細胞增殖、腫瘤轉化、細胞對凋亡的逃避、細胞周期控制喪失、血管生成和轉移。腫瘤細胞的一系列活動依賴于腫瘤微環(huán)境,腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分是炎癥因子,一系列細胞因子和趨化因子能夠在炎癥反應中產生,這些因子在促進腫瘤的轉移和侵襲方面起重要的作用。并且,炎癥因子的聚集,在很大程度上能夠促進腫瘤細胞通過基質細胞,從而促進腫瘤的轉移。線粒體是真核生物細胞內高度動態(tài)的細胞器,其大小、形態(tài)、運動、定位和周轉的變化,與其適應性和功能性改變、質量控制和體內平衡都密切相關。線粒體呈現(xiàn)出長絲狀的網絡結構,當其在整個細胞質中向各個方向運動時,可以看到延伸、收縮、斷裂和融合,并且該特征對于維持線粒體相關的生物活動是必需的,例如細胞生長、分裂、凋亡、衰老和疾病。線粒體直接或間接涉及腫瘤細胞代謝的許多方面。已經有報道顯示,在各種實體瘤和血液惡性腫瘤中,涉及多種線粒體的改變。盡管目前許多研究已提出多種機制來解釋腫瘤細胞的線粒體動力學,但沒有研究來評估炎癥對膠質瘤線粒體的影響。所以探討膠質瘤中線粒體的功能和形態(tài)變化對于解答膠質瘤的發(fā)生與發(fā)展機制非常重要。因此,本研究通過透射電鏡、生物信息學、免疫組化、ELISA、細胞培養(yǎng)、免疫熒光和流式細胞術等主要實驗技術手段研究了膠質瘤中線粒體的形態(tài)和生物學性能,以及炎癥對于膠質瘤細胞中線粒體的影響及對細胞自身的影響,為探討膠質瘤的發(fā)病機制及探尋有效的治療手段提供依據。材料和方法第一部分:膠質瘤組織中的線粒體的代謝異常以及炎癥因子的改變1.對膠質瘤組織進行固定處理,通過透射電鏡觀察線粒體的形態(tài)學改變。2.下載CGGA中的膠質瘤數據,篩選出與糖酵解、電子傳遞鏈和三羧酸循環(huán)相關酶的基因表達數據,統(tǒng)計分析與代謝相關的酶的基因表達改變及病人生存分析;下載與炎癥相關因子的基因表達數據,統(tǒng)計分析膠質瘤中炎癥相關因子的基因表達改變及其與代謝相關酶的表達相關性。3.對膠質瘤組織和癌旁組織進行HE和小膠質細胞標志物Iba1免疫組化染色,觀察膠質瘤組織中的炎癥細胞的浸潤和小膠質細胞的活化情況。4.通過人類蛋白圖譜(http://www.proteinatlas.org/)中提供的膠質瘤中蛋白表達的信息,統(tǒng)計分析線粒體上4種電子傳遞鏈復合體的各個亞基在膠質瘤中的表達變化。第二部分:炎癥對膠質瘤細胞中線粒體生物學性能的影響1.用炎癥因子LPS+IFN-γ聯(lián)合刺激膠質瘤細胞,根據刺激時間分為0 h(刺激前)、4 h、8 h和24 h組,首先用ELISA的方法檢測細胞上清液中的炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-4的表達情況;接下來用免疫熒光和透射電鏡的方法觀察膠質瘤細胞中的線粒體的形態(tài)和亞顯微結構的改變;用WB檢測與線粒體分裂與融合相關的Drp1、Mfn2與Hsp60蛋白表達情況。2.使用MitoSOX-Red檢測LPS+IFN-γ刺激后膠質瘤細胞中mtROS的改變。3.使用線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)檢測LPS+IFN-γ刺激后膠質瘤細胞中線粒體膜電位的改變。4.使用WB檢測與糖酵解、電子傳遞鏈和三羧酸循環(huán)相關酶的蛋白表達情況,檢測LPS+IFN-γ刺激后膠質瘤細胞中代謝重編程的改變。5.用LC 3B標記細胞自噬,使用WB和細胞免疫熒光檢測在LPS+IFN-γ聯(lián)合刺激后膠質瘤細胞中自噬水平的變化。6.用CCK8檢測在LPS+IFN-γ聯(lián)合刺激后,膠質瘤細胞活力的改變;使用Ki-67標記增殖細胞,檢測在LPS+IFN-γ聯(lián)合刺激后,膠質瘤細胞增殖的改變;使用Annexin V FITC/PI雙標法檢測在LPS+IFN-γ聯(lián)合刺激后,膠質瘤細胞凋亡的情況。研究結果1.通過透射電鏡我們觀察到膠質瘤組織中線粒體發(fā)生腫脹、基質空泡化、嵴破壞甚至消失。2.統(tǒng)計分析CGGA數據庫中與代謝相關以及炎癥因子相關的基因表達數據,結果顯示:與LGG相比,GBM中與糖酵解相關酶HK1、LDHA和GAPDH的基因表達增加,并且高表達能夠降低患者的生存率;與三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈相關酶CS和ATP5A的基因表達降低,并且低表達能夠降低患者的生存率。GBM中多種炎性因子的表達也發(fā)生了改變,炎性因子IL-6、IL-8、IL-4和IL-10與糖酵解相關酶HK1、LDHA和GAPDH的表達呈現(xiàn)正相關,與三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈相關酶CS和ATP5A的表達呈現(xiàn)負相關。3.膠質瘤組織和癌旁組織的HE染色結果顯示膠質瘤組織中存在壞死區(qū),并有大量炎癥細胞浸潤,Iba1免疫組化染色顯示小膠質細胞活化,胞體增大,突起回縮。4.統(tǒng)計分析人類蛋白圖譜中線粒體上4種電子傳遞鏈復合體的各亞基的表達,結果顯示多個亞基的表達均發(fā)生了明顯改變;此外,我們通過免疫組化檢測了膠質瘤組織中NADH脫氫酶的亞基Subunit 6、琥珀酸脫氫酶的亞基SDHB以及細胞色素C氧化酶的亞基COX6B1的表達變化情況,結果顯示:與癌旁組織相比,COX6B1顯著增加;與正常腦組織相比,SDHB和Subunit 6的表達顯著降低。5.用LPS+IFN-γ聯(lián)合刺激膠質瘤細胞后,1)細胞上清液中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-4的表達均出現(xiàn)不同程度的改變;2)U118-MG細胞線粒體發(fā)生了斷裂,斷裂的線粒體為球狀、環(huán)狀或C狀;在電鏡下觀察,線粒體發(fā)生了腫脹、基質空泡化、嵴消失、并出現(xiàn)C形線粒體;3)WB結果顯示Hsp60未發(fā)生明顯改變,Drp1表達增加,Mfn2表達降低。6.用LPS+IFN-γ聯(lián)合刺激膠質瘤細胞后,U87-MG中mtROS在4 h和8 h時增加,24 h降低;U118-MG中mtROS無明顯改變。膠質瘤細胞U118-MG的線粒體膜電位在刺激后顯著降低。7.用LPS+IFN-γ聯(lián)合刺激膠質瘤細胞U87-MG后,與糖酵解相關的HK1和LDHA在8 h均有顯著性增加;與三羧酸循環(huán)相關的CS在刺激后均有顯著性增加;電子傳遞鏈復合體亞基COX6B1和SDHB在細胞處理8 h和24 h時均有顯著性降低,ATP5A則無明顯改變。8.用LPS+IFN-γ聯(lián)合刺激膠質瘤細胞后,線粒體的自噬水平、細胞活力和增殖均無明顯改變,而細胞凋亡顯著性降低。結論1.膠質瘤中,線粒體形態(tài)結構異常,代謝發(fā)生重編程,存在炎癥反應,并且代謝與炎癥間具有相關性。2.炎癥可破壞膠質瘤細胞線粒體的形態(tài)結構的完整性,增加mtROS,降低線粒體膜電位;膠質瘤細胞對于炎癥引起的線粒體異常具有耐受性。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.41
【部分圖文】：

圖 1 TEM 檢測膠質瘤組織細胞中線粒體亞顯微結構的變化a 圖：基質空泡化、嵴消失；b 圖為 a 圖方框區(qū)域的放大圖；c 圖：線粒體腫脹、基質空泡狀、嵴破壞和消失；d 圖為 c 圖放大圖 M：線粒體；N：細胞核；紅色箭頭指示線粒體嵴2.2 膠質瘤中與代謝重編程相關的酶的基因表達的改變腫瘤的標志之一是代謝途徑和模式發(fā)生了改變，亦被稱為代謝重編程（Metabolic Reprogramming）。代謝重編程會導致腫瘤細胞對凋亡的逃避，促進其增殖和存活，并促進腫瘤發(fā)展和轉移[37]。上述結果提示膠質瘤組織細胞中的線粒體功能可能受到顯著影響。因此，我們接下來分析細胞代謝過程中相關酶的改變。我們下載 CGGA 數據庫中膠質瘤數據，匯總數據庫中各種腫瘤類型（表 1）。首先篩選與糖酵解相關的酶的基因表達數據，包括己糖激酶 1（Hexokinase1,HK1）、乳酸脫氫酶 A（Lactate Dehydrogenase A, LDHA）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase, GAPDH）。數據分析結果顯示：與 LGG 相比較，GBM 中 HK1、LDHA 和 GAPDH 的 mRNA 表達水平均有顯著性增加（圖 2A-C）；并且，對于三種酶的表達以中位數為界分為高表達組與低表達組，進行生存分析，發(fā)現(xiàn) LDHA 和 GAPDH 的表達水平對患者的生存時間有顯

表 1 CGGA 數據庫中各種腫瘤類型匯總Database Histology Grade SamplesCGGAAstrocytomas (A) Ⅱ 60Oligodendrogliomas (O) Ⅱ 19Oligoastrocytomas (OA) Ⅱ 37Anaplastic Astrocytomas (AA) Ⅲ 15Anaplastic Oligodendrogliomas (AO) Ⅲ 12Anaplastic Oligoastrocytomas (AOA) Ⅲ 22GBM Ⅳ 125

13圖 3 膠質瘤組織中與氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)相關酶的 mRNA 的表達情況（CGGA）A、B 圖：CS 和 ATP5A 的 mRNA 表達情況；C、D 圖：CS 和 ATP5A 對病人生存影響的分析 ***： P < 0.0012.3 膠質瘤組織中炎癥因子基因表達的改變腫瘤微環(huán)境中存在多種炎癥因子，包括促炎因子 IL-1β、IL-6、白細胞介素-8（Interleukin-6, IL-8）和 TNF，以及抑炎因子白細胞介素-1α（Interleukin-1α, IL-1α）、白細胞介素-4（Interleukin-4, IL-4）、白細胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）和白細胞介素-13（Interleukin-13,IL-13）。在 CGGA 數據庫中篩選出這些炎癥因子的基因表達情況，統(tǒng)計分析結果顯示：膠質瘤組織中的多種炎癥因子表達發(fā)生了改變，與 LGG 相比，GBM 中的促炎因子 IL-6 和 IL-8 顯著性增加，TNF 顯著性降低，IL-1β 無明顯改變（圖 4A-D）；抑炎因子 IL-4、IL-10 和 IL-13 在 GBM中亦顯著性增加，IL-1α 無明顯改變（圖 4E-H）。炎癥因子基因表達的改變提示膠質瘤組織中可能存在有炎癥反應！線粒體的代謝重編程是否與炎癥反應相關
【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 胡建宏;王茂林;潘亞文;;高遷移率族蛋白B1在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究[J];國際神經病學神經外科學雜志;2019年02期

2 楊海霞;李曉鳴;;外泌體與膠質瘤關系的研究進展[J];臨床與病理雜志;2017年11期

3 秦麗娟;賈永森;趙喜慶;張?zhí)?張偉;孫娜;;鴉膽子油乳注射液對膠質瘤細胞侵襲性的影響及其可能機制[J];四川大學學報(醫(yī)學版);2016年03期

4 齊玲;徐俊杰;紀朋艷;呂士杰;韓磊;王瑋瑤;;西蘭花多肽抑制膠質瘤細胞生長的機制研究[J];中國藥學雜志;2014年12期

5 萬政強;陳晨;伏林山;孫關;;吡格列酮對膠質瘤細胞生長的抑制研究[J];東南大學學報(醫(yī)學版);2013年01期

6 李?,王楓,繆珊,駱文靜;過量鋅對鼠膠質瘤細胞體外生長的影響[J];解放軍預防醫(yī)學雜志;2001年04期

7 楊偉廉,王堯,韋永新,阮長耿,杜子威;抗膠質瘤細胞單克隆抗體SZ-38及其識別抗原的生化特征[J];生物化學雜志;1988年06期

8 斯可哉;;在體外和體內用利血平調節(jié)C_6膠質瘤細胞亞系對ACNU的抗藥性[J];國外醫(yī)學(腫瘤學分冊);1988年02期

9 楊偉廉;抗膠質瘤細胞單克隆抗體SZ—38及其識別抗原的生化特征[J];蘇州醫(yī)學院學報;1989年01期

10 李方園;高翼之;王世浚;;四種人癌基因在腦瘤中的擴增和重排(摘要)[J];鐵道醫(yī)學;1989年01期

相關博士學位論文 前10條

1 肖瑾;多模態(tài)MRI在人腦膠質瘤病理分級、基因型及其預后評估中的應用[D];安徽醫(yī)科大學;2018年

2 尤昕;Nexilin表達下調對膠質瘤細胞生物學特性的影響及機制研究[D];延邊大學;2015年

3 鄧鑫;HAX-1蛋白通過Akt1通路對膠質瘤細胞增殖和調亡的影響及機制研究[D];鄭州大學;2018年

4 唐純海;miR-130a調控靶基因HMGB2抑制膠質瘤增殖和EMT的分子機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2018年

5 孫瑾;MiR-152-3p靶向調控DNMT1-NF2通路與膠質瘤細胞凋亡、侵襲機制的研究[D];南方醫(yī)科大學;2018年

6 盧鳳飛;miR-497/Wnt3a/c-jun反饋環(huán)路調控神經膠質瘤細胞生長和上皮—間質轉化的分子機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2018年

7 李峰;阻斷CD47-SIRPα信號通路對膠質瘤細胞/膠質瘤干細胞的靶向治療研究[D];南方醫(yī)科大學;2018年

8 王向鵬;膠質瘤相關lncRNA表達譜分析以及PAR5在膠質瘤中的功能和機制研究[D];昆明醫(yī)科大學;2018年

9 薛維爽;長鏈非編碼RNA-PVT1調控miR-190a-5p和miR-488-3p影響膠質瘤細胞生物學行為的機制[D];中國醫(yī)科大學;2016年

10 王昱霖;ARL2通過下調AXL抑制膠質瘤增殖、侵襲和體內成瘤能力[D];中國醫(yī)科大學;2018年

相關碩士學位論文 前10條

1 宋亞男;炎癥對膠質瘤細胞中線粒體生物學性能的影響[D];鄭州大學;2019年

2 譚呼;膠質瘤患者血清MAGE-D4蛋白和抗體的檢測及臨床意義分析[D];廣西醫(yī)科大學;2018年

3 鄔慧賢;miR-200a靶向抑制MAGED4及其對膠質瘤遷移侵襲的影響[D];廣西醫(yī)科大學;2018年

4 王修成;人腦膠質瘤組織中IDH-1和MGMT的表達及相關性研究[D];鄭州大學;2019年

5 劉暢;膠質瘤中啟動子甲基化和轉錄因子Sp1對MAGE-D4的轉錄調控作用[D];廣西醫(yī)科大學;2018年

6 肖冬玲;多模態(tài)磁共振成像在膠質瘤術前分級及與Ki-67、Survivin表達的相關性研究[D];西南醫(yī)科大學;2016年

7 楊亞麗;長鏈非編碼RNA LINC00461調控膠質瘤細胞的增殖和遷移[D];武漢大學;2017年

8 郭彩麗;IKBKE通過激活AKT/NF-KB信號通路調控膠質瘤的生長過程及增強膠質瘤的抗藥性[D];鄭州大學;2019年

9 張仁;lncRNA ENST00000413528作用于miR-593-5p通過調控PLK1對膠質瘤細胞增殖、侵襲和調亡的影響[D];鄭州大學;2019年

10 曾凡濤;IDH1R132H突變與膠質瘤相關性癲癇患者術后癇性再發(fā)的關系[D];鄭州大學;2019年

本文編號：2837620