目的:我們團(tuán)隊(duì)的前期研究發(fā)現(xiàn)癲癇患者及大鼠模型中ZAG表達(dá)降低,ZAG具有抑制癲癇的作用。胰島素和過(guò)表達(dá)ZAG均可抑制癲癇發(fā)作和異常放電,既往研究發(fā)現(xiàn)ZAG可影響多種組織的胰島素敏感性,但胰島素是否調(diào)節(jié)ZAG的表達(dá)目前尚不清楚。癲癇中,氧化應(yīng)激發(fā)揮了重要作用,而胰島素和ZAG在多種疾病中均與氧化應(yīng)激損害有關(guān),但癲癇中ZAG是否具有抗氧化應(yīng)激作用尚不清楚。本研究擬探討胰島素對(duì)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元中ZAG表達(dá)的影響及其機(jī)制,并探索胰島素和ZAG在癲癇誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的作用。方法:1.提取并培養(yǎng)大鼠原代皮層神經(jīng)元,用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元中ZAG的表達(dá);2.用不同濃度(0nM、10nM、50nM、100nM、200nM、500nM)的胰島素干預(yù)皮層神經(jīng)元,用MTS法測(cè)定不同濃度胰島素對(duì)神經(jīng)元活性影響,用RT-qPCR、Western blot測(cè)定不同濃度胰島素干預(yù)條件下神經(jīng)元中AZGP1 mRNA和ZAG表達(dá)量的變化,并通過(guò)AXL1717(IGF-1R拮抗劑)和BMS-754807(IR和IGF-1R拮抗劑)干預(yù)進(jìn)一步探討其作用機(jī)制;3.建立無(wú)鎂細(xì)胞外液培養(yǎng)神經(jīng)元癲癇模型,運(yùn)用RT-qPCR、Western blot方法測(cè)定癲癇模型中AZGP1 mRNA和ZAG蛋白表達(dá)量的變化;4.驗(yàn)證LV的轉(zhuǎn)染效果:將原代皮層神經(jīng)元分為四個(gè)組分別轉(zhuǎn)染慢病毒:過(guò)表達(dá)空載體組(Vector)、過(guò)表達(dá)組(LV-AZGP1)、低表達(dá)空載體組(LV-RNAi-Vector)、低表達(dá)組(LV-RNAi)。運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡觀察、RT-qPCR及Western blot方法檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效果;5.探索胰島素及ZAG在癲癇誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的作用機(jī)制:將培養(yǎng)的神經(jīng)元隨機(jī)分為八個(gè)組,分別給予不同的處理:空白對(duì)照組(Control)、癲癇組(Seizure)、過(guò)表達(dá)空載體組(Vector)、過(guò)表達(dá)組(LV-AZGP1)、低表達(dá)空載體組(LV-RNAi-Vector)、低表達(dá)組(LV-RNAi)、胰島素組(Insulin)、胰島素+低表達(dá)組(Insulin+LV-RNAi)。激光共聚焦下觀察超氧陰離子(O~(2-))的水平并統(tǒng)計(jì)。結(jié)果:1.免疫熒光結(jié)果顯示ZAG在原代皮層神經(jīng)元中有表達(dá);2.MTS結(jié)果顯示低于200nM的胰島素處理對(duì)神經(jīng)元的活性無(wú)影響,但500nM的胰島素降低了神經(jīng)元的活性(P0.05)。RT-qPCR和Western blot結(jié)果分別顯示當(dāng)濃度≤200nM時(shí),胰島素會(huì)增加神經(jīng)元中AZGP1mRNA及ZAG水平,在200nM作用最明顯。AXL1717或BMS-754807處理均可抑制胰島素誘導(dǎo)的ZAG升高;3.RT-qPCR和Western blot結(jié)果分別顯示在無(wú)鎂癲癇模型中AZGP1mRNA及ZAG水平較對(duì)照組明顯降低(P0.01);4.原代皮層神經(jīng)元轉(zhuǎn)染慢病毒后,綠色熒光結(jié)果顯示神經(jīng)元慢病毒轉(zhuǎn)染成功,RT-qPCR及Western blot結(jié)果顯示,與相應(yīng)對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)組AZGP1 mRNA和ZAG在病毒轉(zhuǎn)染72小時(shí)后顯著增加(P0.01),低表達(dá)組AZGP1 mRNA和ZAG在病毒轉(zhuǎn)染72小時(shí)后顯著降低(P0.01);5.Seizure組超氧陰離子(O~(2-))產(chǎn)生增加,過(guò)表達(dá)AZGP1和胰島素可減輕O~(2-)的產(chǎn)生,低表達(dá)AZGP1可增加O~(2-)的產(chǎn)生。與胰島素組相比,Insulin+LV-RNAi組O~(2-)的產(chǎn)生明顯增加。結(jié)論:在原代皮層神經(jīng)元中,胰島素主要通過(guò)作用于IGF-1R誘導(dǎo)ZAG表達(dá)增加。在神經(jīng)元癲癇模型中,胰島素發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用可能是通過(guò)增高ZAG水平實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R742.1
【文章目錄】：
英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照
中文摘要
abstract
前言
1 材料與方法
2 結(jié)果
3 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述：氧化應(yīng)激在癲癇中的研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文和學(xué)術(shù)成果

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