背景:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腦腫瘤,具有增殖迅速、侵襲性強(qiáng)、治療效果差、復(fù)發(fā)率高、生存期短等特點(diǎn)。目前針對(duì)腦腫瘤的基礎(chǔ)研究取得了很大進(jìn)展,但這些進(jìn)展并沒(méi)有顯著改善患者的預(yù)后,在傳統(tǒng)治療干預(yù)的情況下GBM患者的平均總生存期只有15個(gè)月左右。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSCs)自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)已被廣泛研究,盡管GSCs在膠質(zhì)瘤中只是數(shù)量極少的一個(gè)亞群,但其顯著區(qū)別于普通的腫瘤細(xì)胞,因其具有自我更新、無(wú)限增殖、多向分化和重建腫瘤的潛能,是維持并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵,在一定意義上決定著腫瘤的化療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)。因此,靶向GSCs可能為高級(jí)別膠質(zhì)瘤病患提供更有效的治療方法。為了解膠質(zhì)瘤干細(xì)胞區(qū)別于分化的普通膠質(zhì)瘤細(xì)胞的特異性分子機(jī)制,我們前期使用iTRAQ聯(lián)合2D LC-MS/MS的蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)比分析了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞相對(duì)于其分化細(xì)胞的特異性的差異蛋白,發(fā)現(xiàn)ATP1A1在GSCs中異常高表達(dá),可能是靶向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的潛在靶點(diǎn)。方法:在本研究中,為了進(jìn)一步了解ATP1A1在原代人GSCs的惡性表型和發(fā)病機(jī)制中的作用,我們首先分離培養(yǎng)出原代人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行貼壁培養(yǎng),檢測(cè)了不同等級(jí)膠質(zhì)瘤中ATP1A1的表達(dá),檢測(cè)了GSCs及分化的GBM細(xì)胞中ATP1A1的表達(dá),最終選擇兩株原代GSCs用于后續(xù)的研究。隨后構(gòu)建了ATP1A1慢病毒干擾的GSCs,并檢測(cè)干擾組(sh-ATP1A1 GBM GSCs)和對(duì)照組(sh-NC GBMGSCs)增殖及凋亡和體內(nèi)成瘤的能力的變化;檢測(cè)sh-ATP1A1GBM GSCs/sh-NC GBMGSCs中MAPK和PI3K信號(hào)通路變化并檢測(cè)到ATP1A1作用于MAPK和PI3K信號(hào)通路的重要節(jié)點(diǎn)Src;檢測(cè)ATP1A1與Src的互作關(guān)系及干擾ATP1A1表達(dá)后Src磷酸化水平的變化;最后利用sh-Src慢病毒,在恢復(fù)了ATP1A1表達(dá)的GSCs中干擾Src的表達(dá),檢測(cè)Src下調(diào)后細(xì)胞的增殖和凋亡能力的變化。結(jié)果:我們從人原代膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中成功分離出膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,并可通過(guò)預(yù)涂層粘連蛋白和多聚賴(lài)氨酸使GSCs單層貼壁培養(yǎng),通過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)細(xì)胞具有二次成球能力并表達(dá)干細(xì)胞的標(biāo)志物SOX2和NESTIN;誘導(dǎo)分化后細(xì)胞表達(dá)分化標(biāo)志物GFAP。另外我們發(fā)現(xiàn)ATP1A1更優(yōu)先表達(dá)于高級(jí)別的膠質(zhì)瘤中,且相對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞,其干細(xì)胞中ATP1A1表達(dá)顯著上調(diào);敲低ATP1A1后,GSCs增殖受到抑制,細(xì)胞周期阻滯,凋亡增加,體內(nèi)成瘤能力下降;p-AKT、p-ERK1/2活性降低;Src為ATP1A1調(diào)控AKT和ERK的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn);且ATP1A1與Src有直接或間接的互作關(guān)系,ATP1A1下調(diào)后GSCs中Src活化水平也隨之下調(diào);最后恢復(fù)ATP1A1表達(dá)的GSCs中下調(diào)Src的表達(dá)以后,細(xì)胞表現(xiàn)為增殖抑制、凋亡增加。結(jié)論:ATP1A1在GSCs中高表達(dá)并可調(diào)控GSCs的增殖和凋亡,其可能通過(guò)與Src直接或間接互作影響Src的磷酸化水平從而調(diào)控Src介導(dǎo)的MAPK和PI3K信號(hào)通路活性,從而影響細(xì)胞的增殖與凋亡。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R739.4
【部分圖文】：

18 1.1 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的成球、貼壁生長(zhǎng)與分化 A：膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GBM GSCs1 和 GBMCs2）的懸浮成球生長(zhǎng)，具有成球能力（100×） B：膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)（200×） C：膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化細(xì)胞（GBM1 和 GBM2）的生長(zhǎng)（100×）。Figure 1.1 Stem cell spheres, adherent growth and differentiation of glioma stem cellsA: Suspendedspheresof glioma stem cells (GBM GSCs) (100×) B: Adherent growth ofglioma stem cells (200×) C: Growth of glioma stem cell differentiated cells (100×).2 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞免疫熒光鑒定

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文SOX2 和 NESTIN 是最被廣泛認(rèn)可的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，我們對(duì)膠質(zhì)瘤貼壁干細(xì)胞進(jìn)行SOX2和NESTIN的免疫熒光染色，以便觀察單個(gè)細(xì)胞的染色狀態(tài)，在激光共聚焦顯微鏡下我們可觀察到膠質(zhì)瘤干細(xì)胞紅色膜染色和綠色核染色，表明該細(xì)胞可共表達(dá) SOX2 和 NESTIN (圖 1.3)，同時(shí)也驗(yàn)證了所培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。

膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化細(xì)胞分化標(biāo)志物GFAP免疫熒光鑒定標(biāo)尺，50μm
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本文編號(hào)：2838044