背景及目的血腦屏障(BBB)是由具有緊密連接結(jié)構(gòu)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMEC)、基膜、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞(足突)共同構(gòu)成的結(jié)構(gòu),其中基膜在血腦屏障組裝中起到不可或缺的作用�；ぶ饕衫w連蛋白(fibronectin,FN)、層連蛋白、Ⅳ型膠原、內(nèi)肌動(dòng)蛋白以及一些糖蛋白等組成,一般認(rèn)為FN可介導(dǎo)基膜與周圍細(xì)胞之間的黏附,對(duì)BBB的屏障作用的維持起著重要作用,但BBB基膜中FN的來(lái)源、表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其在維系BBB中的詳細(xì)機(jī)制,目前尚不清楚。近年來(lái),不斷增加的研究顯示,細(xì)胞自噬參與了腦卒中的微血管病變過(guò)程,而且本人所在實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果表明,細(xì)胞自噬的關(guān)鍵因子——自噬相關(guān)蛋白7(Autophagy-related protein 7,Atg7)在腦微血管發(fā)育中起重要作用,但Atg7與BBB基膜成分的關(guān)系,迄今尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文的主要目的是:在觀察腦微血管發(fā)育過(guò)程中FN表達(dá)變化的基礎(chǔ)上,借助模式細(xì)胞(人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,HBMEC)和Atg7血管內(nèi)皮細(xì)胞條件性敲除小鼠,探討Atg7與BBB基膜的主要成分FN表達(dá)的關(guān)系,為進(jìn)一步探討B(tài)BB的穩(wěn)態(tài)維持積累科學(xué)資料。實(shí)驗(yàn)方法一、腦微血管發(fā)育過(guò)程中FN的表達(dá)變化利用Western blot檢測(cè)腦發(fā)育過(guò)程FN的表達(dá)變化。二、利用血管內(nèi)皮細(xì)胞Atg7條件性敲除小鼠,檢測(cè)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中FN的表達(dá)和血腦屏障的通透性1.血管內(nèi)皮細(xì)胞Atg7條件性敲除小鼠的制備和鑒定。2.用Atg7條件性敲除小鼠和野生對(duì)照小鼠制作腦震蕩切片。3.利用組織免疫熒光法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中FN表達(dá)水平。4.小鼠腹腔注射伊文思藍(lán),利用組織免疫熒光法檢測(cè)Atg7條件性敲除小鼠和野生對(duì)照小鼠血腦屏障通透性。三、應(yīng)用模式細(xì)胞(HBMEC)研究Atg7與FN表達(dá)的關(guān)系1.構(gòu)建Atg7穩(wěn)定干擾的HBMEC(人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞)細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株。2.用Real-time PCR,Western blot以及細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)Atg7和FN的表達(dá)變化。四、Atg7調(diào)控FN表達(dá)機(jī)制的初步研究以信號(hào)通路抑制劑處理HBMEC,利用RT-qPCR檢測(cè)不同抑制劑處理后的FN表達(dá)水平,以及抗p65抗體的免疫熒光(檢測(cè)p65入核)方法以確定參與Atg7調(diào)控FN表達(dá)變化的信號(hào)通路。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、小鼠腦內(nèi)FN表達(dá)隨時(shí)間減少利用western blot檢測(cè)出生后1、3、7、14、30、60天的小鼠大腦內(nèi)FN的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:小鼠腦內(nèi)FN表達(dá)的高峰出現(xiàn)在第14天,這與小鼠腦微血管發(fā)育的高峰期一致,提示腦內(nèi)檢測(cè)到的FN可能主要來(lái)源于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。二、在Atg7條件性敲除小鼠中,腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中FN的表達(dá)下降,血腦屏障通透性升高用四個(gè)月齡的內(nèi)皮細(xì)胞敲除Atg7(Atg7~(-/-))的小鼠和同窩野生對(duì)照小鼠,制作振蕩切片,組織免疫熒光染色檢測(cè)Atg7在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示:與野生對(duì)照小鼠相比,CD31定位內(nèi)皮細(xì)胞,Atg7條件性敲除小鼠中,其FN熒光亮度顯著降低。三、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中,干擾Atg7導(dǎo)致FN表達(dá)降低1.用Real-time PCR檢測(cè)Atg7穩(wěn)定干擾細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞的mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示:與對(duì)照細(xì)胞株相比,干擾Atg7的表達(dá)后,FN的mRNA表達(dá)水平顯著降低。2.用Western blot檢測(cè)Atg7穩(wěn)定干擾細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞的總蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示:與對(duì)照細(xì)胞株相比,干擾Atg7表達(dá)后,FN的蛋白表達(dá)水平也顯著降低。3.用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)Atg7穩(wěn)定干擾細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞組分泌到胞外基質(zhì)中的表達(dá)變化,結(jié)果顯示:與對(duì)照細(xì)胞株相比,Atg7穩(wěn)定干擾細(xì)胞株分泌到胞外基質(zhì)的FN蛋白明顯降低。四、NF-κB信號(hào)通路可能參與了Atg7導(dǎo)致的FN表達(dá)下調(diào)在信號(hào)通路抑制劑條件下使用RT-qPCR檢測(cè)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中FN轉(zhuǎn)錄水平,以及抗p65抗體的免疫熒光(檢測(cè)p65入核)結(jié)果顯示:NF-κB信號(hào)通路可能參與了Atg7導(dǎo)致的FN表達(dá)下調(diào)。結(jié)論與野生型對(duì)照小鼠相比,腦血管內(nèi)皮細(xì)胞條件性敲除Atg7的小鼠,其腦微血管基膜中的FN的表達(dá)顯著降低,血腦屏障通透性增加。體外培養(yǎng)的HBMEC中,干擾Atg7表達(dá)導(dǎo)致FN的mRNA和蛋白水平都顯著降低,提示Atg7通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控FN的表達(dá)。NF-κB信號(hào)通路可能參與了Atg7導(dǎo)致的FN表達(dá)下調(diào)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R743.3
【部分圖文】：

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果天數(shù)的小鼠腦內(nèi) FN 的表達(dá)情況鼠發(fā)育過(guò)程中大腦內(nèi) FN 的表達(dá)情況。我們利用 wester3、7、14、30 以及 60 天的小鼠大腦內(nèi) FN 的表達(dá)情況。 FN 表達(dá)的高峰出現(xiàn)在第 14 天，這與小鼠腦微血管發(fā)育測(cè)到的 FN 可能主要來(lái)源于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。N）1 3 7 14 3060

圖 2：鼠尾提取的 DNA 鑒定轉(zhuǎn)基因鼠的基因型。鼠尾 DNA 經(jīng) PCR 擴(kuò)增后，行瓊脂糖凝膠電泳，本圖的 1，2，4，5，6 為純合型小鼠(Atg7-/-小鼠)。3.3 血管內(nèi)皮特異性敲除 Atg7 的小鼠腦中 FN 表達(dá)水平顯著降低，血腦屏障通透性顯著升高我們采用免疫熒光對(duì)血管內(nèi)皮特異性敲除 Atg7（Atg7-/-）的小鼠腦震蕩切片中的 FN 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示血管內(nèi)皮特異性敲除 Atg7 的小鼠腦中 FN 的表達(dá)水平較野生鼠顯著降低（圖 3）。接下來(lái)，我們向小鼠體內(nèi)注射 Evans Blue，30min后灌流取腦并進(jìn)行冰凍切片，對(duì)血管內(nèi)皮特異性敲除 Atg7 小鼠的血腦屏障通透性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示血管內(nèi)皮特異性敲除 Atg7 小鼠的 Evans Blue 滲漏程度較野生鼠顯著增加（圖 4），這說(shuō)明血管內(nèi)皮特異性敲除 Atg7 小鼠的血腦屏障通透性與野生鼠相比顯著升高。

圖 2：鼠尾提取的 DNA 鑒定轉(zhuǎn)基因鼠的基因型。鼠尾 DNA 經(jīng) PCR 擴(kuò)增后，脂糖凝膠電泳，本圖的 1，2，4，5，6 為純合型小鼠(Atg7-/-小鼠)。血管內(nèi)皮特異性敲除 Atg7 的小鼠腦中 FN 表達(dá)水平顯著降低，血腦通透性顯著升高我們采用免疫熒光對(duì)血管內(nèi)皮特異性敲除 Atg7（Atg7-/-）的小鼠腦震蕩切片中N 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示血管內(nèi)皮特異性敲除 Atg7 的小鼠腦中 FN 的表平較野生鼠顯著降低（圖 3）。接下來(lái)，我們向小鼠體內(nèi)注射 Evans Blue，30min流取腦并進(jìn)行冰凍切片，對(duì)血管內(nèi)皮特異性敲除 Atg7 小鼠的血腦屏障通透性了分析，結(jié)果顯示血管內(nèi)皮特異性敲除 Atg7 小鼠的 Evans Blue 滲漏程度較野顯著增加（圖 4），這說(shuō)明血管內(nèi)皮特異性敲除 Atg7 小鼠的血腦屏障通透性與鼠相比顯著升高。FN CD31 DAPI Merge
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Dynamic expression of extracellular signal-regulated kinase in rat liver tissue during hepatic fibrogenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2006年39期

本文編號(hào)：2836609