目的:探討不同濃度程序性壞死特異性抑制劑Necrostatin-1(Nec-1)對海人酸(kainic acid,KA)誘導(dǎo)小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE)后海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的作用,并探討Nec-1對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用最佳的濃度。方法:將252只體重25-30g雄性ICR小鼠隨機(jī)分為DMSO組、DMSO+KANICE ACID組、不同劑量Nec-1干預(yù)(10μmol·L-1、20μmol·L-1、40μmol·L-1、80μmol·L-1)組,共6個組。采用腹腔注射海人酸12mg/kg建立小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型,于腹腔注射前15min經(jīng)左側(cè)腦室給予不同濃度干預(yù)劑Nec-1。在模型成功后不同時間點(diǎn)(24h、48h、72h)通過Western blot方法檢測海馬組織中程序性壞死相關(guān)蛋白RIP1、MLKL以及凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3、Bax的表達(dá)情況,篩選癲癇發(fā)生后上述蛋白表達(dá)最明顯時間點(diǎn)。免疫組化和Western blot方法檢測海馬組織中程序性壞死相關(guān)蛋白RIP1、RIP3、MLKL以及凋亡相關(guān)蛋白B-cell lymphoma 2(Bcl-2)、Cleaved-caspase3、Bax的表達(dá)情況。采用免疫組化H-E染色觀察小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的的病理形態(tài)學(xué)改變;Tunnel染色檢測小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響,從而篩選出Nec-1保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的最佳濃度。結(jié)果:(1)癲癇發(fā)作后24小時,Western blot顯示:DMSO+KANICE ACID組MLKL、RIP1、Bax、Cleave-caspase3表達(dá)最明顯,DMSO組與DMSO+KANIC ACID組比值最高。(2)癲癇發(fā)作后24小時,Western blot結(jié)果顯示:40μmol·L-1治療組可明顯下調(diào)RIP1、MLKL、RIP3、Cleaved-caspase3、Bax蛋白的表達(dá),上調(diào)Bcl-2表達(dá)。(3)小鼠癲癇發(fā)作后24h IHC結(jié)果顯示:DMSO組RIP1、MLKL、RIP3、Cleaved-caspase3、Bax蛋白的表達(dá)量均較少,癲癇發(fā)作后海馬組織中RIP1、MLKL、RIP3、Cleaved-caspase3、Bax蛋白量顯著增加(P0.05)。給予Nec-1干預(yù)之后,隨著濃度增加細(xì)胞陽性率呈下降趨勢,80μmol·L-1治療組較40μmol·L-1治療組出現(xiàn)輕微上升趨勢,40μmol·L-1Nec-1治療組可顯著下調(diào)RIP1、MLKL、RIP3、cleaved-caspase3、Bax蛋白的表達(dá)(P0.05)。(4)HE染色可見DMSO組海馬CA3區(qū)細(xì)胞排列整齊,形態(tài)正常;DMSO+KANIC ACID組細(xì)胞排列散亂,部分胞漿有空泡形成,有的神經(jīng)元腫脹、分布不均、核固縮、核仁消失;40μmol·L-1Nec-1治療組能明顯減輕神經(jīng)元胞體腫脹、核固縮等細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。(5)TUNEL染色可見DMSO組海馬CA3區(qū)可見少量棕褐色的TUNEL陽性顆粒細(xì)胞,而DMSO+KANICE ACID組海馬CA3區(qū)可見大量棕褐色陽性細(xì)胞。與DMSO+KANICE ACID組相比,40μmol·L-1Nec-1組CA3區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少(P0.05)。結(jié)論:1.與DMSO+KANICE ACID組相比,40μmol·L-1 Nec-1治療組下調(diào)RIP1、MLKL、RIP3、Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá)最明顯。2.40μmol·L-1Nec-1治療組對KA誘導(dǎo)的小鼠SE后海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用較其他濃度治療組更為明顯。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R742.1
【部分圖文】：

圖 1 小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)（A—Ⅳ級 雙側(cè)前肢抽搐伴站立 B—Ⅴ級 全身強(qiáng)直-陣攣抽搐伴跌倒）。2.海人酸誘導(dǎo)小鼠 SE 后(24h、48h、72h)海馬組織 RIP1 、MLKLCleaved-Caspase3、Bax 蛋白的影響癲癇發(fā)作后 24，48，72h，采用 Western blot 法檢測小鼠海馬組織凋亡及程序性壞死相關(guān)蛋白，結(jié)果表明，DMSO+KANICACID 組與 DMSO 組 MLKL、RIP1Bax、Cleaved-caspase3 蛋白表達(dá)比值最高。我推測海人酸誘導(dǎo)小鼠癲癇模型作用24h 對小鼠海馬組織的損傷最明顯，因此本課題選定 24h 為實(shí)驗(yàn)作用時間。

A B圖 1 小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)（A—Ⅳ級 雙側(cè)前肢抽搐伴站立 B—Ⅴ級 全身強(qiáng)直-陣攣抽搐伴跌倒）。2.海人酸誘導(dǎo)小鼠 SE 后(24h、48h、72h)海馬組織 RIP1 、MLKL、Cleaved-Caspase3、Bax 蛋白的影響癲癇發(fā)作后 24，48，72h，采用 Western blot 法檢測小鼠海馬組織凋亡及程序性壞死相關(guān)蛋白，結(jié)果表明，DMSO+KANICACID 組與 DMSO 組 MLKL、RIP1、Bax、Cleaved-caspase3 蛋白表達(dá)比值最高。我推測海人酸誘導(dǎo)小鼠癲癇模型作用24h 對小鼠海馬組織的損傷最明顯，因此本課題選定 24h 為實(shí)驗(yàn)作用時間。

3. HE 染色檢測不同劑量 Nec-1 對海人酸誘導(dǎo)小鼠 SE 后海馬神經(jīng)元的影響HE 染色觀察 CA3 區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果顯示；DMSO 組海馬組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列規(guī)整，著色均勻，胞核及核仁大小正常，胞漿及胞核染色清亮，呈淺紅色和淡藍(lán)色。DMSO+KANICE ACID 組細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)明顯紊亂，錐體細(xì)胞明顯丟失，胞漿透明，胞核及胞漿染色呈深藍(lán)色和紫藍(lán)色，且著色不均勻，大小不一，形態(tài)各異，有些神經(jīng)元發(fā)生腫脹呈透明空泡化，有些神經(jīng)元體積縮小，細(xì)胞核固縮深染、核仁變小甚至消失，尤以 CA3 區(qū)更為顯著。隨著 Nec-1 治療組濃度的加深雖可見細(xì)胞排列紊亂減輕，胞核深染與皺縮減少，其中 40umolNec-1治療組細(xì)胞排列規(guī)整，較 DMSO+KANICE ACID 組有明顯改善，(詳見圖 3 A～F)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2833263