發(fā)布時間：2020-10-09 05:00

　　 目的:探討不同濃度程序性壞死特異性抑制劑Necrostatin-1(Nec-1)對海人酸(kainic acid,KA)誘導小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE)后海馬區(qū)神經(jīng)細胞的作用,并探討Nec-1對神經(jīng)細胞保護作用最佳的濃度。方法:將252只體重25-30g雄性ICR小鼠隨機分為DMSO組、DMSO+KANICE ACID組、不同劑量Nec-1干預(10μmol·L-1、20μmol·L-1、40μmol·L-1、80μmol·L-1)組,共6個組。采用腹腔注射海人酸12mg/kg建立小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型,于腹腔注射前15min經(jīng)左側(cè)腦室給予不同濃度干預劑Nec-1。在模型成功后不同時間點(24h、48h、72h)通過Western blot方法檢測海馬組織中程序性壞死相關(guān)蛋白RIP1、MLKL以及凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3、Bax的表達情況,篩選癲癇發(fā)生后上述蛋白表達最明顯時間點。免疫組化和Western blot方法檢測海馬組織中程序性壞死相關(guān)蛋白RIP1、RIP3、MLKL以及凋亡相關(guān)蛋白B-cell lymphoma 2(Bcl-2)、Cleaved-caspase3、Bax的表達情況。采用免疫組化H-E染色觀察小鼠海馬神經(jīng)元細胞的的病理形態(tài)學改變;Tunnel染色檢測小鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡的影響,從而篩選出Nec-1保護神經(jīng)細胞的最佳濃度。結(jié)果:(1)癲癇發(fā)作后24小時,Western blot顯示:DMSO+KANICE ACID組MLKL、RIP1、Bax、Cleave-caspase3表達最明顯,DMSO組與DMSO+KANIC ACID組比值最高。(2)癲癇發(fā)作后24小時,Western blot結(jié)果顯示:40μmol·L-1治療組可明顯下調(diào)RIP1、MLKL、RIP3、Cleaved-caspase3、Bax蛋白的表達,上調(diào)Bcl-2表達。(3)小鼠癲癇發(fā)作后24h IHC結(jié)果顯示:DMSO組RIP1、MLKL、RIP3、Cleaved-caspase3、Bax蛋白的表達量均較少,癲癇發(fā)作后海馬組織中RIP1、MLKL、RIP3、Cleaved-caspase3、Bax蛋白量顯著增加(P0.05)。給予Nec-1干預之后,隨著濃度增加細胞陽性率呈下降趨勢,80μmol·L-1治療組較40μmol·L-1治療組出現(xiàn)輕微上升趨勢,40μmol·L-1Nec-1治療組可顯著下調(diào)RIP1、MLKL、RIP3、cleaved-caspase3、Bax蛋白的表達(P0.05)。(4)HE染色可見DMSO組海馬CA3區(qū)細胞排列整齊,形態(tài)正常;DMSO+KANIC ACID組細胞排列散亂,部分胞漿有空泡形成,有的神經(jīng)元腫脹、分布不均、核固縮、核仁消失;40μmol·L-1Nec-1治療組能明顯減輕神經(jīng)元胞體腫脹、核固縮等細胞形態(tài)學變化。(5)TUNEL染色可見DMSO組海馬CA3區(qū)可見少量棕褐色的TUNEL陽性顆粒細胞,而DMSO+KANICE ACID組海馬CA3區(qū)可見大量棕褐色陽性細胞。與DMSO+KANICE ACID組相比,40μmol·L-1Nec-1組CA3區(qū)TUNEL陽性細胞明顯減少(P0.05)。結(jié)論:1.與DMSO+KANICE ACID組相比,40μmol·L-1 Nec-1治療組下調(diào)RIP1、MLKL、RIP3、Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達最明顯。2.40μmol·L-1Nec-1治療組對KA誘導的小鼠SE后海馬神經(jīng)元的保護作用較其他濃度治療組更為明顯。
【學位單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R742.1
【部分圖文】：

圖 1 小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)（A—Ⅳ級 雙側(cè)前肢抽搐伴站立 B—Ⅴ級 全身強直-陣攣抽搐伴跌倒）。2.海人酸誘導小鼠 SE 后(24h、48h、72h)海馬組織 RIP1 、MLKLCleaved-Caspase3、Bax 蛋白的影響癲癇發(fā)作后 24，48，72h，采用 Western blot 法檢測小鼠海馬組織凋亡及程序性壞死相關(guān)蛋白，結(jié)果表明，DMSO+KANICACID 組與 DMSO 組 MLKL、RIP1Bax、Cleaved-caspase3 蛋白表達比值最高。我推測海人酸誘導小鼠癲癇模型作用24h 對小鼠海馬組織的損傷最明顯，因此本課題選定 24h 為實驗作用時間。

A B圖 1 小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)（A—Ⅳ級 雙側(cè)前肢抽搐伴站立 B—Ⅴ級 全身強直-陣攣抽搐伴跌倒）。2.海人酸誘導小鼠 SE 后(24h、48h、72h)海馬組織 RIP1 、MLKL、Cleaved-Caspase3、Bax 蛋白的影響癲癇發(fā)作后 24，48，72h，采用 Western blot 法檢測小鼠海馬組織凋亡及程序性壞死相關(guān)蛋白，結(jié)果表明，DMSO+KANICACID 組與 DMSO 組 MLKL、RIP1、Bax、Cleaved-caspase3 蛋白表達比值最高。我推測海人酸誘導小鼠癲癇模型作用24h 對小鼠海馬組織的損傷最明顯，因此本課題選定 24h 為實驗作用時間。

3. HE 染色檢測不同劑量 Nec-1 對海人酸誘導小鼠 SE 后海馬神經(jīng)元的影響HE 染色觀察 CA3 區(qū)細胞形態(tài)學變化，結(jié)果顯示；DMSO 組海馬組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)正常，細胞排列規(guī)整，著色均勻，胞核及核仁大小正常，胞漿及胞核染色清亮，呈淺紅色和淡藍色。DMSO+KANICE ACID 組細胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)明顯紊亂，錐體細胞明顯丟失，胞漿透明，胞核及胞漿染色呈深藍色和紫藍色，且著色不均勻，大小不一，形態(tài)各異，有些神經(jīng)元發(fā)生腫脹呈透明空泡化，有些神經(jīng)元體積縮小，細胞核固縮深染、核仁變小甚至消失，尤以 CA3 區(qū)更為顯著。隨著 Nec-1 治療組濃度的加深雖可見細胞排列紊亂減輕，胞核深染與皺縮減少，其中 40umolNec-1治療組細胞排列規(guī)整，較 DMSO+KANICE ACID 組有明顯改善，(詳見圖 3 A～F)。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 孟曙慶;張洪;;難治性癲癇的治療進展[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2013年15期

2 曹麗麗;董艷;徐婧婧;林幽町;遲令懿;遲兆富;;Wortmannin通過抑制癲癇大鼠海馬自噬活性發(fā)揮神經(jīng)保護作用[J];中國病理生理雜志;2010年08期

3 于光耀;賈彩云;馬遠方;;Necroptosis的調(diào)控機制及其在組織及細胞缺血損傷中的作用和意義[J];醫(yī)學分子生物學雜志;2009年06期

4 陳功;江澄川;孫靜;楊茹;;難治性顳葉癲癇患者海馬與致癇大鼠海馬病理學的比較研究[J];中華實驗外科雜志;2007年03期

本文編號：2833263