背景和目的:腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見的惡性腫瘤,起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng),約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的45%。形態(tài)上,膠質(zhì)瘤呈浸潤生長,侵襲性生長,界限不清,因此手術(shù)很難完全切除,術(shù)后易復(fù)發(fā)。盡管以手術(shù)為主聯(lián)合放射治療及化學(xué)治療的綜合方案已成為治療指南,但是對(duì)于高級(jí)別膠質(zhì)瘤(WHO分級(jí)Ⅲ級(jí),Ⅳ級(jí))患者,在影像導(dǎo)引、神經(jīng)電生理監(jiān)測等新技術(shù)的輔助下進(jìn)行“最大范圍的安全切除”后,結(jié)果也并不十分理想,預(yù)后改善不顯著。MicroRNAs(即miRNAs,微小RNAs)是一種小的非編碼RNA。近年來,國內(nèi)外對(duì)miRNA進(jìn)行了大量研究。目前已知其在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮了重要的作用,并且近年來被認(rèn)為是抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)。大多數(shù)的miRNAs通過直接靶向作用于癌基因或抑癌基因,從而參與了人類各種腫瘤發(fā)生及其惡性表型。在本研究中,我們研究了一種在膠質(zhì)瘤中研究較少的MicroRNA,即Micro-330-5p。該MicroRNA的靶向基因是ITGA5。然而,ITGA5在不同腫瘤中的作用不同,其在膠質(zhì)瘤中的功能也尚未清楚。本文旨在研究miRNA-330-5p及其靶基因ITGA5在膠質(zhì)瘤中的功能和作用。該項(xiàng)研究為miRNA-330-5p可以作為膠質(zhì)瘤診斷和治療的靶點(diǎn)提供了理論依據(jù),為腫瘤進(jìn)展過程中的分子調(diào)控機(jī)制研究提供了一個(gè)全新方向。方法:通過RT-qPCR技術(shù)檢測miR-330-5p和ITGA5 mRNA在GBM細(xì)胞系(U87、U251和U373)和正常腦膠質(zhì)細(xì)胞(HEB)中的表達(dá)。Western blot技術(shù)檢測ITGA5以及相關(guān)惡性表型蛋白的表達(dá)。采用MTT法、集落形成法、Transwell法、劃痕實(shí)驗(yàn)法、流式細(xì)胞術(shù)測定GBM細(xì)胞的生物學(xué)功能(包括細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡、細(xì)胞周期等方面)。通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測,確定miR-330-5p與ITGA5的靶向關(guān)系。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測miR-330-5p是否在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮同樣的功能。結(jié)果:RT-qPCR檢測miR-330-5p在GBM細(xì)胞系(U87、U251和U373)和人GBM腦組織中低表達(dá),在正常腦膠質(zhì)細(xì)胞(HEB)和非腫瘤腦組織中高表達(dá)。Western blot檢測ITGA5蛋白在膠質(zhì)瘤中高表達(dá),并且上調(diào)miR-330-5p可以降低Ki67,N-Cadherin和MMP2的表達(dá),促進(jìn)caspase-3的激活。通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測,確定了miR-330-5p可以靶向抑制ITGA5的表達(dá)。MTT法、菌落形成法、Transwell法、創(chuàng)面愈合法、流式細(xì)胞術(shù)測定GBM細(xì)胞的生物學(xué)功能顯示,miR-330-5p上調(diào)和ITGA5下調(diào)對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移均有抑制作用。同時(shí),它們還能促進(jìn)GBM細(xì)胞凋亡。裸鼠皮下呈瘤結(jié)果顯示,與NC組比較,miR-330-5p上調(diào)的細(xì)胞系成瘤速度較慢。在體內(nèi)所表達(dá)的侵襲、增殖的相關(guān)蛋白表達(dá)較低,而凋亡率較高。結(jié)論:miRNA-330-5p可以靶向抑制癌基因ITGA5的表達(dá),從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。因此,對(duì)miR-330-5p抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性表型的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究,將為膠質(zhì)瘤的臨床診療提供新的方向,具有重要的臨床意義。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.4
【部分圖文】：

圖 1. MicroRNA-330-5p 在 GBM 及細(xì)胞系中低表達(dá)(A) qRT-PCR 結(jié)果顯示 miR-330-5p 在非腫瘤腦組織（NBT，n=5）與 GBM 組織（n=8）的表達(dá)差異，在 GBM 中低表達(dá)。（B）qRT-PCR 結(jié)果顯示 miR-330-5p 在人正常膠質(zhì)細(xì)胞 HEB，高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 U87,U251,U373 中的表達(dá)差異。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中低表達(dá)，其中 U251 中表達(dá)最低。(C)組織 Fish 結(jié)果顯示 miR-330-5p在非腫瘤腦組織與 GBM 組織的表達(dá)差異。（D）Fish 結(jié)果的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。所有的實(shí)驗(yàn)都是重復(fù) 3 遍。* P < 0.05;** P <0.01，*** P < 0.001。

圖 2. （A）ITGA5 在 TCGA 數(shù)據(jù)庫中分析的結(jié)果中提示，在 NBT 和 GBM 中存在表達(dá)差異。（B）免疫組化提示 ITGA5 在 GBM 中高表達(dá)。（C）Western Blot 結(jié)果顯示 ITGA5 在膠質(zhì)細(xì)胞系 U87、U251 和 U373 中高表達(dá)，尤其是在 U251 中表達(dá)最高。（D）Western Blot結(jié)果統(tǒng)計(jì)。所有的實(shí)驗(yàn)都是重復(fù) 3 遍。* P < 0.05;** P < 0.01，*** P < 0.001。

南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3. ITGA5 是 miR-330-5p 的下游靶點(diǎn)為了驗(yàn)證我們的預(yù)測，我們進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因檢測。如圖所示，我們發(fā)現(xiàn)隨著 miR-330-5p mimic 的存在，ITGA5-wt 組的熒光素酶活性較 NC 組明顯降低(P<0.05)，說明 miR-330-5p 可以直接靶向 ITGA5（圖 3A，B）。另外，我們利用 Western blot 檢測 miR-330-5p 對(duì) ITGA5 表達(dá)水平的影響。我們可以很容易地觀察到，在轉(zhuǎn)染 miR-330-5p 或 siRNA-ITGA5 的細(xì)胞中，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染 NC 或?qū)φ战M相比，ITGA5 的 mRNA 和蛋白水平均顯著下降。過表達(dá) ITGA5 可恢復(fù)miR-330-5p mimics 的作用(P<0.05，圖 3C 和 D)，提示 miR-330-5p 可抑制 GBM細(xì)胞中 ITGA5 的表達(dá)。

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