研究背景:周圍神經(jīng)病變是常見的糖尿病并發(fā)癥,其確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。lncRNA和miRNA廣泛參與了各種生物學(xué)過程,對疾病的發(fā)生發(fā)展起了關(guān)鍵的作用,然而在糖尿病周圍神經(jīng)病變中卻尚未被系統(tǒng)研究。本研究分為兩部分,結(jié)合mRNA,分別研究miRNA和lncRNA在糖尿病周圍神經(jīng)病變中的作用。第一部分糖尿病周圍神經(jīng)病變miRNA-mRNA調(diào)節(jié)機(jī)制分析目的:全面揭示糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠背根神經(jīng)節(jié)中差異表達(dá)的miRNA及其靶基因mRNA在神經(jīng)病變中的調(diào)節(jié)作用。方法:使用20只8周齡、體重在180-220g的健康雄性SD大鼠,隨機(jī)分成兩組(糖尿病組和對照組)。禁食不禁水12小時(shí)后,糖尿病組腹腔注射鏈脲佐菌素(65mg/kg),對照組腹腔注射等體積的檸檬酸鹽緩沖液。7天后取尾靜脈血檢測非空腹血糖,血糖大于16.7mM表示糖尿病誘導(dǎo)成功。繼續(xù)飼養(yǎng)8周后評估周圍神經(jīng)是否發(fā)生病變,我們采用電子測痛儀(Electronic Von Frey)測量縮足反應(yīng)閾值以及坐骨神經(jīng)橫截面透射電鏡兩種方法進(jìn)行評估。隨后對大鼠處以安樂死,收集雙側(cè)L3-L6背根神經(jīng)節(jié),提取總RNA。采用微陣列芯片篩選出差異表達(dá)的miRNA和mRNA(Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 Array和Affymetrix GeneChip Rat Transcriptome Array 1.0)。利用miRanda數(shù)據(jù)庫,對miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測,然后與篩選出的差異mRNA取交集,并進(jìn)一步篩選出與相應(yīng)miRNA呈負(fù)相關(guān)的mRNA。對所得出的mRNA進(jìn)行GO和pathway分析,鑒別出富集的基因功能和信號通路,同時(shí)結(jié)合差異miRNA構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),進(jìn)一步鑒別出網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵調(diào)控基因。最后,我們對關(guān)鍵的miRNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果:非空腹血糖檢測提示1只實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖不符合標(biāo)準(zhǔn),因此排除。與對照組相比,糖尿病組的縮足反應(yīng)閾值顯著降低,透射電鏡提示坐骨神經(jīng)明顯的髓鞘分離和脫髓鞘。通過微陣列芯片檢測,我們發(fā)現(xiàn)了37個(gè)miRNA和1357個(gè)mRNA在糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠背根神經(jīng)節(jié)中差異表達(dá)。對篩選出的mRNA做GO和pathway分析,共得出399個(gè)顯著富集的GO terms(257個(gè)為下調(diào)、142個(gè)為上調(diào))和29個(gè)顯著富集的pathway(23個(gè)為下調(diào)、6個(gè)為上調(diào))。對miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,我們得出rno-miR-330-5p,rno-miR-17-1-3p和rno-miR-346可能是網(wǎng)絡(luò)的核心,而mRNA中Podxl和Hoxa1擁有最高的連接度。PCR的驗(yàn)證結(jié)果與基因芯片結(jié)果相一致。結(jié)論:本研究成功誘導(dǎo)了糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠,并篩選出了糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠背根神經(jīng)節(jié)中異常表達(dá)的miRNA和mRNA。通過GO分析、pathway分析和miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析,我們發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因可能對糖尿病周圍神經(jīng)病變起了重要的作用。第二部分糖尿病周圍神經(jīng)病變lncRNA-mRNA表達(dá)譜分析及ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建目的:綜合分析lncRNA和mRNA的生物信息學(xué)功能,以及在糖尿病周圍神經(jīng)病變中的作用,同時(shí)構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA網(wǎng)絡(luò)。方法:糖尿病造模、組織取材同第一部分。采用微陣列芯片Affymetrix GeneChip Rat Transcriptome Array 1.0篩選異常表達(dá)的lncRNA和mRNA。對差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行GO和pathway分析,鑒別出富集的基因功能和信號通路。將GO和pathway分析結(jié)果的交叉基因進(jìn)行signal-net分析,鑒別出可能的關(guān)鍵基因。建立lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),確定lncRNA與mRNA的相互作用模型,進(jìn)而分析lncRNA在糖尿病周圍神經(jīng)病變中可能的調(diào)節(jié)作用。根據(jù)競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)假說,結(jié)合所獲得的差異miRNA、lncRNA和mRNA數(shù)據(jù),我們進(jìn)一步建立ceR NA網(wǎng)絡(luò),探討ceR NA網(wǎng)絡(luò)在糖尿病周圍神經(jīng)病變中的作用。最后,我們對其中的關(guān)鍵基因進(jìn)行了PCR和Western blot驗(yàn)證。結(jié)果:我們共發(fā)現(xiàn)了983個(gè)lncRNA和1357個(gè)mRNA異常表達(dá)。對這1357的差異表達(dá)mRNA做GO和pathway分析,共得出558個(gè)顯著富集的GO term(s368個(gè)為下調(diào)、190個(gè)為上調(diào))和94個(gè)顯著富集的pathway(57個(gè)為下調(diào)、37個(gè)為上調(diào))。signal-net分析提示Plcd和Itgb3擁有最高的中介中心性(betweenness centrality),而整合素受體(Itgb3、Itgb1、Itgb8和Itga6)擁有最高的連接度,提示這些mRNA的重要性。我們建立的lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中,共包含474個(gè)lncRNA和169個(gè)mRNA。網(wǎng)絡(luò)中包含1426個(gè)lncRNA-mRNA連接,其中569個(gè)為負(fù)相關(guān),857個(gè)為正相關(guān),lncRNA speegaw.aSep08-unspliced具有最高的連接度,而mRNA中Scd1、Map4k4和Tyrp1具有最高的連接度。ceR NA網(wǎng)絡(luò)分析提示,差異基因與鞘脂類代謝等生物過程,以及IL-17信號通路、PPAR信號通路以及Wnt信號通路相關(guān)。PCR和Western blot驗(yàn)證結(jié)果提示基因芯片結(jié)果具有高度的可靠性。結(jié)論:本研究提示差異表達(dá)的lncRNA通過調(diào)節(jié)共表達(dá)的mRNA,對糖尿病周圍神經(jīng)病變的病理過程起了重要調(diào)節(jié)作用。與此同時(shí),ceR NA網(wǎng)絡(luò)也參與糖尿病周圍神經(jīng)病變多種病理生理過程,提示其在疾病中的重要性。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2;R747.9
【部分圖文】：

圖 1-1. 糖尿病大鼠誘導(dǎo)及樣本采集流程。3. 行為學(xué)測試機(jī)械性痛覺超敏（mechanical allodynia）常用于檢測糖尿病周圍神經(jīng)病變的一種

如下圖所示（圖 1-2），我們采用多步分析方法，篩選出糖尿病周圍神經(jīng)神經(jīng)節(jié)中差異表達(dá) miRNA 和 mRNA 并進(jìn)行分析，通過對基因功能和相行分析，同時(shí)建立 miRNA 和 mRNA 的相互調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步篩選出可。

0.001）（圖 1-3-C）。此外，實(shí)驗(yàn)組大鼠也表現(xiàn)出明顯的多尿（158 ± 9 ml/24h vs. 21 ±2 ml/24h，p＜0.001）（圖 1-3-F）、多飲（191 ± 10 ml/24h vs. 51 ± 4 ml/24h，p＜0.001）（圖 1-3-E）以及多食（56.4 ± 2.3 g/24h vs. 22.3 ± 1.6 g/24h，p＜0.001）（圖 1-3-D）。

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本文編號：2831930