目的腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管病造成神經(jīng)功能缺損、致殘乃至死亡的主要原因,目前沒有有效的治療方法,本研究通過建立大腦中動脈腦缺血再灌注動物模型,探討α-硫辛酸對腦缺血再灌注損傷凋亡調(diào)控基因Bax m RNA和JNK3,及炎性因子NF-κB,TNF-α在蛋白和原位雜交水平上表達(dá)的影響,探討藥物干預(yù)后MMP-2、MMP-9的水平,血腦屏障通透性和腦組織含水量的情況,觀察該藥物對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法(1)根據(jù)經(jīng)典Longa法制作大腦中動脈腦缺血再灌注損傷動物模型,假手術(shù)組不插入線栓。雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組),腦缺血再灌注組(模型組,B組),α-硫辛酸預(yù)干預(yù)組(C組),根據(jù)再灌注時間不同又分為6h、12h、24h、48h 4個亞組。(2)α-硫辛酸于恢復(fù)再灌注前30分鐘按照體質(zhì)量20mg/kg進(jìn)行腹腔注射,假手術(shù)組和模型組予以等體積生理鹽水腹腔注射。(3)缺血2h后恢復(fù)再灌注并與各時間點采用Longa法評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分,利用圖像分析軟件Scion Image進(jìn)行腦梗死體積測定,TUNNEL技術(shù)檢測神經(jīng)元凋亡情況,免疫組織化學(xué)檢測NF-κB、TNF-α,MMP-2、MMP-9利用原位雜交技術(shù)檢測NF-κB m RNA、TNF-αm RNA、Bax m RNA,Western Blot方法檢測JNK3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果(1)與假手術(shù)組比較,模型組、α-硫辛酸預(yù)給藥組在各時點凋亡調(diào)控基因Bax m RNA和JNK3蛋白的表達(dá)明顯增高(P0.05)。與模型組比較,α-硫辛酸預(yù)給藥組可改善24h、48h時點的神經(jīng)功能缺損和減少各時點腦梗死體積(P0.05);亦能降低除6h時點以外的各時點凋亡調(diào)控基因Bax m RNA表達(dá)以及24h、48h時點JNK3蛋白的表達(dá)(P0.05)。(2)模型組與假手術(shù)組動物比較,模型組動物NF-κB表達(dá)在缺血再灌注6h后開始升高(P0.05),TNF-α表達(dá)在缺血再灌注24h后的表達(dá)開始升高(P0.05),缺血再灌注3d時兩者均達(dá)到峰值(P0.05),而在缺血再灌注7d時仍高于假手術(shù)組(均P0.05);與模型組比較,α-硫辛酸預(yù)給藥組于腦缺血再灌注24h、3d、7d時NF-κB和TNF-α表達(dá)降低;α-硫辛酸預(yù)給藥組NF-κB各時點組內(nèi)比較未見統(tǒng)計學(xué)差異(F=2.245,P0.05)。與模型組比較,α-硫辛酸預(yù)給藥組梗塞體積明顯減小,神經(jīng)功能缺損評分降低(P0.05)。(3)與假手術(shù)組比較,模型組腦缺血再灌注后EB含量明顯增高。與模型組比較,α-硫辛酸干預(yù)組各時間點EB含量明顯減少,差異明顯(P0.05)。模型組再灌注后24h可見MMP-2陽性細(xì)胞出現(xiàn),3d~7d時達(dá)高峰,與模型組比較,α-硫辛酸預(yù)給藥組MMP-2陽性細(xì)胞數(shù)各時間點均明顯低于模型組。模型組缺血再灌注后MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)12h明顯增高,至2d達(dá)高峰,α-硫辛酸預(yù)給藥組MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)各時間點均明顯低于模型組。結(jié)論(1)α-硫辛酸注射液預(yù)給藥可抑制凋亡調(diào)控基因Baxm RNA及JNK3蛋白的表達(dá),大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡減輕,腦梗死體積減小,神經(jīng)功能改善,其抗凋亡機(jī)制可能與抑制Bax的表達(dá)和阻斷MAPK-JNK3通路有關(guān)。(2)腦缺血再灌注損傷后炎性因子NF-κB和TNF-α高表達(dá),α-硫辛酸預(yù)給藥抑制大鼠腦缺血再灌注損傷后炎性因子表達(dá)。α-硫辛酸可能是通過抑制NF-κB和TNF-α的表達(dá),減輕腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)炎癥,對腦缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷具有明顯的改善作用。(3)α-硫辛酸預(yù)給藥能夠明顯降低缺血再灌后腦組織的EB含量,減輕BBB的開放,減少腦含水量,減輕腦水腫,對缺血性腦組織具有保護(hù)作用。其機(jī)制可能是通過降低MMP-2和MMP-9的表達(dá),減輕炎性反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R743
【部分圖文】：

7圖 1.1 頸部正中切口 圖 1.2 手術(shù)視野圖1.1.3.2 腦組織取材和組織切片制備大鼠經(jīng)腹腔注射 10%水合氯醛麻醉后，迅速暴露心臟，進(jìn)行 0.9%氯化鈉心尖灌注，再進(jìn)行 4%多聚甲醛心尖灌注，充分固定后斷頭取出腦組織（見圖 1.3，圖 1.4）。將腦組織于視交叉吻合端到尾端進(jìn)行片厚約 4μm 的冠狀切片，將切片制成腦組織石蠟切片，用于 HE 染色、原位雜交染色和免疫組化實驗。圖 1.3 生理鹽水心尖灌注 圖 1.4 充分固定后的腦組織1.1.3.3 神經(jīng)功能評分采用 Longa 法于再灌注各時間點對動物進(jìn)行神經(jīng)功能評分。0 分：活動正常，無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；1 分：左前肢在提尾時不能伸展；2 分：左側(cè) Honer 征，爬行時向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3 分：行走時向左側(cè)傾倒；4 分：不能自主活動或意識喪失。得分為 1~4 分的動物表示腦缺血再灌注模型造模成功。1.1.3.4 腦梗死體積檢測大鼠經(jīng)脫頸處死后

圖 1.1 頸部正中切口 圖 1.2 手術(shù)視野圖1.1.3.2 腦組織取材和組織切片制備大鼠經(jīng)腹腔注射 10%水合氯醛麻醉后，迅速暴露心臟，進(jìn)行 0.9%氯化鈉心尖灌注，再進(jìn)行 4%多聚甲醛心尖灌注，充分固定后斷頭取出腦組織（見圖 1.3，圖 1.4）。將腦組織于視交叉吻合端到尾端進(jìn)行片厚約 4μm 的冠狀切片，將切片制成腦組織石蠟切片，用于 HE 染色、原位雜交染色和免疫組化實驗。

圖 1.1 頸部正中切口 圖 1.2 手術(shù)視野圖1.1.3.2 腦組織取材和組織切片制備大鼠經(jīng)腹腔注射 10%水合氯醛麻醉后，迅速暴露心臟，進(jìn)行 0.9%氯化鈉心尖灌注，再進(jìn)行 4%多聚甲醛心尖灌注，充分固定后斷頭取出腦組織（見圖 1.3，圖 1.4）。將腦組織于視交叉吻合端到尾端進(jìn)行片厚約 4μm 的冠狀切片，將切片制成腦組織石蠟切片，用于 HE 染色、原位雜交染色和免疫組化實驗。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 丁黎敏;灻小民;張微;陸如鳳;;原花青素通過對Caspase-3和Bcl-xl、Bax蛋白的調(diào)節(jié)抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2013年03期

本文編號：2831242