癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的慢性疾病之一,約1/4為藥物難治性癲癇,其中70%為顳葉癲癇。我們前期研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)制備大鼠顳葉癲癇(Temporal lobe epilepsy,TLE)模型,發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元損傷,運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)將TLE大鼠海馬組織與正常對(duì)照組及手術(shù)組進(jìn)行比較,鑒定出一系列差異表達(dá)蛋白質(zhì),其中腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(Collapsion response mediator protein,CRMP-2)為下調(diào)最顯著的蛋白質(zhì),提示其與TLE的發(fā)病密切相關(guān)。CRMP-2是CRMP家族5中亞型之一,主要表達(dá)于成人大腦的高度可塑性區(qū)域,如海馬、嗅球和小腦。CRMP-2有促進(jìn)軸突生長(zhǎng)的作用,而磷酸化的CRMP-2失去促進(jìn)軸突生長(zhǎng)的作用。顳葉癲癇海馬神經(jīng)元損傷或抗損傷的過(guò)程中可能是通過(guò)CRMP-2及其磷酸化調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。目的:觀察CRMP-2在海人酸(KA)點(diǎn)燃癲癇大鼠模型中的海馬的時(shí)空表達(dá)變化及其磷酸化調(diào)節(jié),并探討CRMP-2在顳葉癲癇海馬神經(jīng)元損傷或抗損傷過(guò)程中是通過(guò)其磷酸化作用調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的。方法:選取雄性Wistar大鼠64只,體重250-300g,采用海馬杏仁核注射海人酸制備大鼠癲癇模型,將大鼠分為正常對(duì)照組(CONT)、假手術(shù)組(SHAM)、海人酸致癇組。通過(guò)Western Blot、免疫組織化學(xué)染色,檢測(cè)致癇后不同時(shí)間點(diǎn)(3h、6h、24h、3d、7d、14d)癲癇大鼠海馬CRMP-2及其磷酸化后的表達(dá)變化,并通過(guò)HE染色方法觀察其病理變化結(jié)果:(1)HE染色觀察致癇后海馬的病理變化,CONT組和SHAM組的大鼠可見(jiàn)海馬區(qū)錐體細(xì)胞及齒狀回顆粒細(xì)胞形態(tài)正常,排列整齊,結(jié)構(gòu)完整。與KA組相比,海馬CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞損傷最嚴(yán)重。KA致癇大鼠病理改變?cè)缙?3h)以神經(jīng)元變性為主,可見(jiàn)細(xì)胞間質(zhì)水腫。隨后(6h)主要病理學(xué)改變是神經(jīng)元壞死。隨著病程進(jìn)展,(24h、3d)海馬神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生明顯的丟失或死亡,海馬CA3區(qū)大片狀壞死,多數(shù)細(xì)胞完全脫落消失,部分細(xì)胞收縮,核固縮、破碎、溶解,核仁消失,可見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生和毛細(xì)血管增多改變。最后(7d、14d)病情進(jìn)一步加重,可見(jiàn)明顯的神經(jīng)元脫失,殘存的神經(jīng)元排列紊亂,細(xì)胞層基本消失,區(qū)域界限模糊,不同程度的膠質(zhì)細(xì)胞增生。(2)Western Blot法檢測(cè)KA致癇后大鼠的海馬CRMP-2表達(dá)在3h、6h、24h、3d、7d、14d時(shí)間的變化是先升高后逐漸降低的,KA致癇后3h大鼠的海馬CRMP-2的表達(dá)量迅速增多達(dá)高峰,但第14d略高于第7d。KA致癇后3h、6h、3d、7d、14d的CRMP-2的表達(dá)量與SHAM組相比較,有顯著性差異(P0.05)。(3)Western Blot法檢測(cè)KA致癇后大鼠的海馬p CRMP-2表達(dá)在3h、6h、24h、3d、7d、14d時(shí)間的變化是先降低后逐漸升高的,海人酸致癇后大鼠海馬p CRMP-2表達(dá)水平3h開(kāi)始下降,6h達(dá)最低,隨后逐漸升高。KA致癇后各時(shí)間點(diǎn)的p CRMP-2的表達(dá)量與SHAM組相比較,均有顯著性差異(P0.05)。(4)免疫組織化學(xué)染色方法觀察海馬CA3、CA1、DG各區(qū)在假手術(shù)組、致癇后3h、6h、24h、3d、7d、14d的CRMP-2及p CRMP-2的表達(dá),KA致癇后大鼠的海馬CRMP-2表達(dá)在3h、6h、24h、3d、7d時(shí)間的變化為先升高后降低的趨勢(shì),但第14d較第7d是升高的。KA致癇后各時(shí)間點(diǎn)的CRMP-2的表達(dá)量與SHAM組相比較,有顯著性差異(P0.05)。在海人酸致癇后3h、6h、24h、3d大鼠海馬CA3區(qū)p CRMP-2表達(dá)的變化為降低的趨勢(shì),7d、14d略微升高。KA致癇后各時(shí)間點(diǎn)的p CRMP-2的表達(dá)量與SHAM組相比較,均有顯著性差異(P0.05)。KA致癇后大鼠海馬CA1、DG區(qū)CRMP-2及其p CRMP-2的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)未見(jiàn)明顯變化趨勢(shì)。結(jié)論:(1)在癲癇組大鼠海馬神經(jīng)元損傷以CA3區(qū)為主,CA1、DG區(qū)細(xì)胞形態(tài)完整,排列整齊。因此,CA3區(qū)最容易出現(xiàn)神經(jīng)元過(guò)度興奮而致神經(jīng)元死亡。(2)海人酸致癇后CRMP-2在大鼠海馬組織表達(dá)變化為先升高后逐漸降低的趨勢(shì),而p CRMP-2(Thr514)是先降低后升高的趨勢(shì)。(3)海人酸致癇后大鼠海馬CRMP-2及其磷酸化蛋白表達(dá)水平存在時(shí)空表達(dá)差異,CRMP-2及其磷酸化可能參與了癲癇后神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的調(diào)節(jié),在癲癇過(guò)程中可能與神經(jīng)元損傷密切相關(guān)。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R742.1
【部分圖文】：

圖 3.1 大鼠立體定向手術(shù)模式圖4）將預(yù)先裝有 0.4ugKA(制備癲癇模型用）或等量 PBS(制備假手術(shù)組用）的微量注射器固定于定位儀上，使注射器尖端位于前囟，打開(kāi)定位儀數(shù)字顯示器并歸零；按照《大鼠腦立體定向圖譜》［58］（如圖 3.1），將 BLA 坐標(biāo)如下：縱軸在前囟后 2.5mm，右側(cè)旁開(kāi) 4.5mm，深度距顱骨表面 8.5mm；先使微量注射器的尖端位于前囟后 2.5mm 及中線右側(cè) 4.5mm 處，用電鉆鉆一圓孔，直徑為1.0mm，深度達(dá)硬腦膜表面，且不損及腦組織。5）將微量注射器沿鉆孔進(jìn)針，深度 8.5mm，調(diào)整微量注射器速度，使 KA或 PBS 緩慢、勻速地注射完畢，留置 10min 后緩慢退出注射器，注意避免進(jìn)退針過(guò)快所致的溶液外溢而影響吸收效果。6）操作過(guò)程按無(wú)菌手術(shù)規(guī)則進(jìn)行，注射后將少許青霉素粉涂在皮膚切開(kāi)處，然后縫合切口，將大鼠單獨(dú)放回籠中飼養(yǎng)，用攝像機(jī)進(jìn)行行為學(xué)記錄。

圖 4.1 海人酸致癇組的海馬與正常對(duì)照組的對(duì)比變化將大鼠海馬各區(qū)在高倍鏡下放大后，海人酸致癇后的不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，而海馬 CA1、DG 區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊(見(jiàn)圖 4.2、3、4）。分別計(jì)數(shù)進(jìn)行定量分析(如表 1），發(fā)現(xiàn)大鼠致癇后海馬 CA3 區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞存活數(shù)逐漸減少，而海馬 CA1、DG 區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞存活數(shù)基本保持不變。表 4.1 海馬各區(qū)神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）cont sham 3h 6h 24h 3d 7d 14d PCA1 68.67±2.0366.33±1.2072.33±1.8667.00±2.0873.01±0.5874.8±1.5370.67±0.8877.67±2.03>0.05CA3 26.33±0.3328.00±0.5818.33±0.3316.00±0.5811.67±0.589.33±0.587.67±0.334.33±0.33<0.05

觀察 cont 組和 sham 組的大鼠海馬 CA1 區(qū)錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常。致癇后的 3h、6h 大鼠海馬 CA1 區(qū)細(xì)胞間質(zhì)水腫較輕，而細(xì)胞形態(tài)基本正常，致癇后 24h、3d、7d、14d 海馬 CA1 區(qū)細(xì)胞與 sham 組比較未見(jiàn)異常。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 林華;吳立文;黃遠(yuǎn)桂;陳云春;溫曉妮;;海馬苔蘚纖維出芽及突觸重組與顳葉癲癇的相關(guān)性研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2007年05期

本文編號(hào)：2831175