膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。作為腫瘤細(xì)胞的體積調(diào)節(jié)蛋白,NKCC1(Sodium-potassium-chloride cotransporter 1鈉鉀氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體1)的表達(dá)量隨膠質(zhì)瘤的惡性程度逐級(jí)遞增,并且NKCC1被提示與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲程度相關(guān)。然而,關(guān)于NKCC1在膠質(zhì)瘤中上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化過程(epithelial to mesenchymal-like transition process)的研究鮮有報(bào)道。前期研究中我們觀察到改變NKCC1蛋白量的表達(dá)可以導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞的形態(tài)、極性及細(xì)胞間黏附發(fā)生改變。文中,我們研究了NKCC1是否可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化樣過程。布美他嗪特異性藥物抑制NKCC1以及敲低NKCC1表達(dá)均可有效降低間質(zhì)型標(biāo)記的表達(dá),如N-cadherin,vimentin和snail,而增加了上皮型標(biāo)記物的表達(dá),如E-cadherin,提示NKCC1可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。本研究提示NKCC1的活性增高在膠質(zhì)瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中扮演了重要的角色,這或許為抑制惡性顱內(nèi)腫瘤的遷移播散提供了新的治療策略。本課題研究不同侵襲播散程度膠質(zhì)瘤組織中NKCC1的表達(dá),并在體外實(shí)驗(yàn)研究NKCC1在膠質(zhì)瘤中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的作用及其可能機(jī)制。課題研究分為以下四個(gè)部分:1、NKCC1在不同組織級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法對(duì)我院手術(shù)采集的52例不同病理級(jí)別的膠質(zhì)瘤組織樣本制作而成的組織芯片進(jìn)行檢測(cè),分析樣本中NKCC1表達(dá)情況的差異。采用western blot的方法篩選出表達(dá)NKCC1蛋白較高的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,本院采集的膠質(zhì)瘤活體組織樣本中,NKCC1在伴有明顯顱內(nèi)播散及多灶性特征的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織樣本中高度表達(dá),影像學(xué)顯示腫瘤范圍相對(duì)局限的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者組織樣本中則相對(duì)低表達(dá);且在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織樣本較較低級(jí)別膠質(zhì)瘤樣本中表達(dá)增高。2、NKCC1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。使用western blot檢測(cè)顯示U87和SNB19兩個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中NKCC1蛋白表達(dá)量較高,用于后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)研究。應(yīng)用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,在U87和SNB19兩種細(xì)胞系中,應(yīng)用干擾NKCC1表達(dá)的shRNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染,分為shNKCC1-1組、shNKCC1-2組和scrambled組(轉(zhuǎn)入無義序列);另外使用特異性抑制劑布美他嗪抑制NKCC1活性,分為control組、BMT(10μΜ)組、BMT(100μΜ)組)。western blot檢測(cè)不同的處理組中NKCC1蛋白表達(dá)量,Transwel實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。結(jié)果顯示,應(yīng)用shRNA敲低NKCC1組以及藥物抑制NKCC1組膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力均受到抑制。3、NKCC1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化功能的影響。應(yīng)用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,在U87和SNB19兩種細(xì)胞系中,應(yīng)用干擾NKCC1表達(dá)的shRNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染以及特異性藥物抑制NKCC1的方法,在不同的處理組中,western blot及細(xì)胞免疫熒光方法分別檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示:藥物處理組以及NKCC1敲低組間質(zhì)型相關(guān)蛋白發(fā)生表達(dá)下調(diào),上皮型蛋白上調(diào),表明NKCC1可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系EMT轉(zhuǎn)化。4、NKCC1通過激活Rac1和RhoA信號(hào)通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析顯示SLC12A2基因的表達(dá)量與RAC1和RHOA基因的表達(dá)量呈正相關(guān)。通過GST-TRBD與GST-PBD下拉實(shí)驗(yàn),在U87-MG和SNB19膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中,布美他嗪藥物抑制組較藥物溶媒組RhoA和Rac1活性水平降低。在U87-MG和SNB19膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中,NKCC1敲低組的細(xì)胞較空載對(duì)照組的RhoA和Rac1活性水平更低。最后,通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)證實(shí),Rac1或者RhoA小分子抑制劑(Y27632、NSC23766)聯(lián)合NKCC1抑制(布美他嗪藥物抑制或者NKCC1基因敲低)與NKCC1單獨(dú)抑制對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這證實(shí)了在NKCC1調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中,需要RhoA和Rac1的激活,且該信號(hào)通路單向有效。結(jié)論:1、發(fā)生顱內(nèi)播散的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中NKCC1表達(dá)量顯著高于未發(fā)現(xiàn)明顯顱內(nèi)播散樣本;膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織樣本中NKCC1表達(dá)明顯高于較低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織樣本。2、抑制NKCC1蛋白的表達(dá)及活性功能,均可有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力。3、NKCC1可以促進(jìn)U-87和SNB19細(xì)胞系上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,減少細(xì)胞間黏附,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的適形播散。4、NKCC1作為上游調(diào)控蛋白,通過激活Rac1和RhoA信號(hào)通路,對(duì)膠質(zhì)瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程進(jìn)行誘導(dǎo)。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.41
【部分圖文】：

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NKCC1在不同組織學(xué)級(jí)別膠質(zhì)瘤樣本中的表達(dá)情況：(a)截取8位伴有明顯顱內(nèi)播散、具有多發(fā)腫瘤灶的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的MRI影像片；(b)組織芯片分析高侵襲性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本瘤中心與瘤周NKCC1表達(dá)量；(c)免疫組化檢測(cè)高侵襲組膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本與較低侵襲組膠

Westernblot檢測(cè)NKCC1蛋白的表達(dá)量篩選出高表達(dá)細(xì)胞系（β-tublin作為陽性對(duì)照）

Westernblot檢測(cè)shRNA敲低NKCC1后NKCC1蛋白的表達(dá)（β-actin作為陽性對(duì)照）

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本文編號(hào)：2830166