帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的主要病理特征為中腦黑質(zhì)(substantia nigra,SN)區(qū)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元丟失,殘存神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)以Alpha-突觸核蛋白(alpha-synuclein,α-syn)為主要成分的路易小體(Lewy bodies,LBs),紋狀體(striatum,Str)區(qū)DA釋放減少。其主要臨床表現(xiàn)有運動癥狀,包括:震顫麻痹、肌僵直、運動遲緩和姿勢反射障礙等,大多數(shù)的PD病人還會伴有焦慮、抑郁、嗅覺障礙和便秘等非運動癥狀。通常非運動癥狀的出現(xiàn)會早于運動癥狀幾年甚至十幾年。雖然炎癥、蛋白質(zhì)異常聚集、SN區(qū)鐵沉積、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和凋亡等均與PD發(fā)病有關(guān),但確切發(fā)病原因與機制尚不完全清楚。因此,確定PD的病因,研究出相應(yīng)的防治策略,對治療PD或延緩PD的進程顯得尤為重要。α-syn是由140個氨基酸組成并廣泛存在于突觸前神經(jīng)元中。研究表明,α-syn能夠促進DA的合成、參與囊泡的形成與轉(zhuǎn)運以及神經(jīng)遞質(zhì)穩(wěn)態(tài)與釋放的調(diào)節(jié)等。另外,異常聚集與突變的α-syn參與了PD的發(fā)病,α-syn也是第一個發(fā)現(xiàn)的與PD發(fā)病有關(guān)的蛋白。研究發(fā)現(xiàn),α-syn的異常聚集通常伴隨著鐵的沉積。本實驗室前期研究已證實SN區(qū)鐵含量的升高能夠造成DA能神經(jīng)元的死亡,鐵能夠加速α-syn的聚集。二價金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白(divalent metaltransporter 1,DMT1)是鐵轉(zhuǎn)入蛋白,而鐵轉(zhuǎn)運蛋白1(ferroportin 1,FPN1)是目前已知的唯一的跨膜鐵轉(zhuǎn)出蛋白。SN區(qū)鐵含量的增高與DMT1蛋白表達(dá)的升高和FPN1蛋白表達(dá)的降低有關(guān),同時,DMT1和FPN1蛋白表達(dá)的變化受鐵調(diào)節(jié)蛋白1(iron regulatory protein 1,IRP1)的調(diào)控。PD病人中DA能神經(jīng)元的缺失主要發(fā)生在SN區(qū),而DA能神經(jīng)元同樣富集的腹側(cè)中腦被蓋區(qū)(ventral tegmental area,VTA)卻無明顯變化。本實驗室在PD小鼠模型中發(fā)現(xiàn),鐵沉積特異性出現(xiàn)在SN區(qū)而VTA區(qū)并無鐵沉積,α-syn聚集體出現(xiàn)在SN區(qū)而VTA區(qū)未見α-syn聚集體。為探究在體狀態(tài)下α-syn對SN和VTA區(qū)鐵代謝的影響,我們利用腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的α-syn分別注射到小鼠的SN和VTA區(qū),4周后通過酶聯(lián)免疫吸附測定、蛋白質(zhì)免疫印跡實驗、免疫組織化學(xué)和免疫熒光實驗檢測小鼠SN、Str和VTA區(qū)α-syn含量和酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)表達(dá)的變化,利用Perls’鐵染色技術(shù)檢測SN和VTA區(qū)鐵陽性細(xì)胞數(shù)目的變化,通過電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)檢測小鼠SN和Str區(qū)總鐵含量的變化,通過爬桿測試檢測小鼠運動速度的變化,轉(zhuǎn)棒測試檢測小鼠運動協(xié)調(diào)能力的改變,通過曠場測試分別檢測小鼠自發(fā)運動總距離的變化和小鼠焦慮程度的變化。實驗結(jié)果如下:(一)SN區(qū)過表達(dá)α-syn實驗結(jié)果1.小鼠SN區(qū)注射α-syn 4周后,與對照組相比,α-syn組小鼠SN區(qū)人源α-syn含量增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01,n=6),TH蛋白表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001,n=6),TH陽性細(xì)胞數(shù)目減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01,n=6);Str區(qū)α-syn蛋白表達(dá)水平顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,n=6),TH蛋白表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001,n=6)。2.小鼠SN區(qū)注射α-syn 4周后,通過轉(zhuǎn)棒實驗發(fā)現(xiàn),與對照組相比,α-syn組小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上停留時間明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01,n=10);通過爬桿實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,α-syn組小鼠調(diào)頭時間與爬桿總時間均明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01,n=9-10);曠場實驗結(jié)果表明,與對照組小鼠相比,α-syn組小鼠自發(fā)運動距離明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,n=9)。3.小鼠SN區(qū)注射α-syn 4周后,通過曠場實驗中小鼠在中間區(qū)域與外周區(qū)域的所處時間比值發(fā)現(xiàn),與對照組相比,α-syn組小鼠焦慮程度明顯上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,n=10)。4.小鼠SN區(qū)注射α-syn 4周后,運用ICP-MS檢測結(jié)果表明,與對照組相比,α-syn組小鼠SN區(qū)總鐵水平增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01,n=6),SN區(qū)鐵染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001,n=6);α-syn組小鼠Str區(qū)總鐵水平增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001,n=6)。5.小鼠SN區(qū)注射α-syn 4周后,與對照組相比,α-syn組小鼠SN區(qū)DMT1蛋白表達(dá)上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,n=6),FPN1蛋白表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,n=6),IRP1蛋白表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,n=6);與對照組相比,α-syn組小鼠Str區(qū)FPN1蛋白表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,n=6)。(二)VTA區(qū)過表達(dá)α-syn實驗結(jié)果1.小鼠VTA區(qū)注射α-syn 4周后,與對照組小鼠相比,α-syn組小鼠VTA區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01,n=6)。2.小鼠VTA區(qū)注射α-syn 4周后,與對照組小鼠相比,α-syn組小鼠VTA區(qū)鐵陽性細(xì)胞數(shù)目無明顯變化,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,n=6)。3.小鼠VTA區(qū)注射α-syn 4周后,與對照組小鼠相比,α-syn組小鼠VTA區(qū)DMT1陽性細(xì)胞數(shù)目無明顯變化,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,n=6)。以上實驗結(jié)果提示,SN區(qū)過表達(dá)α-syn會導(dǎo)致小鼠SN區(qū)DA能神經(jīng)元受損,小鼠運動速度和運動協(xié)調(diào)能力受損,SN與Str區(qū)總鐵水平增加。其鐵水平增加可能是與DMT1表達(dá)的增多加快了鐵的轉(zhuǎn)入,FPN1表達(dá)的降低減少了鐵的轉(zhuǎn)出有關(guān),而DMT1和FPN1表達(dá)的變化可能受IRP1的調(diào)節(jié)。VTA區(qū)過表達(dá)α-syn會導(dǎo)致小鼠VTA區(qū)DA能神經(jīng)元受損,不會引起鐵水平的增加和DMT1表達(dá)的增加。綜上所述,SN區(qū)過表達(dá)α-syn能夠引起SN區(qū)鐵的沉積,而VTA區(qū)α-syn過表達(dá)不會影響VTA區(qū)鐵水平,其可能與某些鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白在SN和VTA區(qū)表達(dá)不同有關(guān)。
【學(xué)位單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R742.5
【文章目錄】：
摘要
abstract
引言
材料和方法
    1 動物準(zhǔn)備
    2 實驗方法
        2.1 動物行為學(xué)測試
        2.2 鐵染色
        2.3 免疫組織化學(xué)檢測
        2.4 免疫熒光檢測
        2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗
        2.6 電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)檢測小鼠各腦區(qū)總鐵含量
        2.7 酶聯(lián)免疫吸附測定
        2.8 統(tǒng)計學(xué)處理
結(jié)果
    1.SN區(qū)過表達(dá)α-syn對小鼠鐵代謝的影響
        1.1 AAV介導(dǎo)的EGFP與 α-syn在小鼠SN區(qū)的表達(dá)
        1.2 小鼠SN區(qū)人源α-syn含量的檢測
        1.3 SN區(qū)過表達(dá)α-syn對小鼠SN區(qū) TH陽性細(xì)胞數(shù)和TH蛋白表達(dá)的影響
        1.4 SN區(qū)過表達(dá)α-syn對小鼠運動能力的影響
        1.5 SN區(qū)過表達(dá)α-syn對小鼠焦慮程度的影響
        1.6 SN區(qū)過表達(dá)α-syn對小鼠SN區(qū)總鐵水平和鐵染色陽性細(xì)胞數(shù)目的影響
        1.7 SN區(qū)過表達(dá)α-syn對小鼠SN區(qū) DMT1、FPN1和IRP1 蛋白表達(dá)的影響
        1.8 SN區(qū)過表達(dá)α-syn對小鼠Str區(qū)總鐵水平的影響
        1.9 SN區(qū)過表達(dá)α-syn對小鼠Str區(qū) α-syn、TH和 FPN1 蛋白表達(dá)的影響
    2.VTA區(qū)過表達(dá)α-syn對小鼠鐵代謝的影響
        2.1 AAV介導(dǎo)的EGFP與 α-syn在小鼠VTA區(qū)的表達(dá)
        2.2 VTA區(qū)過表達(dá)α-syn對小鼠VTA區(qū) TH陽性細(xì)胞數(shù)的影響
        2.3 VTA區(qū)過表達(dá)α-syn對小鼠VTA區(qū)鐵陽性細(xì)胞數(shù)的影響
        2.4 VTA區(qū)過表達(dá)α-syn對小鼠VTA區(qū) DMT1 陽性細(xì)胞數(shù)的影響
討論
結(jié)論
參考文獻
綜述
    綜述參考文獻
攻讀學(xué)位期間的研究成果
縮略詞表
致謝

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本文編號：2826877