【研究背景與目的】甲醛(Formaldehyde,FA)具有神經(jīng)毒性,我們課題組以往研究發(fā)現(xiàn)硫化氫(Hydrogen sulfide,H_2S)可拮抗FA誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞毒性,但是H_2S對(duì)FA誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞毒性保護(hù)機(jī)制遠(yuǎn)未闡述清楚,前期我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)FA誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞毒性與鐵死亡密切相關(guān)。鐵蛋白是機(jī)體重要的鐵儲(chǔ)存蛋白,其可通過鐵自噬來釋放鐵實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的調(diào)控,然而過度鐵自噬可誘發(fā)鐵死亡。本課題擬觀察FA是否能誘導(dǎo)HT22細(xì)胞鐵自噬-鐵死亡以及H_2S是否能夠拮抗FA引起的HT22細(xì)胞鐵自噬-鐵死亡,從鐵自噬-鐵死亡途徑探討H_2S拮抗FA神經(jīng)毒性的保護(hù)機(jī)制�！痉椒ā繜晒怆p標(biāo)法觀察NCOA4與LC3B或FTH1的共定位;mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染熒光顯微鏡分析GFP-LC3熒光斑;臺(tái)盼藍(lán)染色拍照觀察細(xì)胞活力、FITC/PI或者7AAD/PE染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞死亡;酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked Immunosorbent Assay,Elisa)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和4-羥基壬烯醛(4-Hydroxynonenal,4-HNE)的含量;BODIPY~(TM)581/591 C11檢測(cè)細(xì)胞脂質(zhì)活性氧含量;鈣黃綠素(Calcein-acetoxymethlester,Ca-AM)染色流式檢測(cè)細(xì)胞Fe~(2+)含量;Western blot分別檢測(cè)微管結(jié)合蛋白1A與1B的第三條輕鏈(Microtubule-associated,LC3II/I)、泛素結(jié)合蛋白(Sequestosome-1,p62/SQSTMI)、鐵蛋白重鏈-1(Ferritin heavy polypeptide 1,FTH1)、以及核受體輔酶激活蛋白4(Nuclear receptor coactivator,NCOA4)的表達(dá)。【結(jié)果】1.將FA(50、100、200μM)與HT22細(xì)胞共孵育24 h后,FA能劑量依賴性地增加HT22細(xì)胞死亡率,降低細(xì)胞內(nèi)GSH含量,增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧、MDA、4-HNE和游離Fe~(2+)的含量,表明FA可引發(fā)HT22細(xì)胞鐵死亡。2.去鐵草酰胺(Desferrioxamine,DFO),一種鐵離子螯合劑10μM預(yù)處理30 min能拮抗FA誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞死亡率增加,細(xì)胞內(nèi)GSH含量降低,脂質(zhì)活性氧、MDA、4-HNE和游離Fe~(2+)含量的增加,表明鐵離子的過度釋放介導(dǎo)了FA誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞鐵死亡。3.FA(50、100、200μM,24 h)能促進(jìn)NCOA4與LC3B或FTH1共定位、GFP-LC3熒光斑增加、自噬相關(guān)蛋白LC3II/I上調(diào)和p62下調(diào),同時(shí)使FTH1下降和NCOA4的上調(diào),表明FA可引發(fā)HT22細(xì)胞鐵自噬。4.NCOA4 shRNA能取消FA誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞死亡率增加、細(xì)胞內(nèi)GSH含量的降低、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧、MDA、4-HNE和游離Fe~(2+)含量的增加,表明鐵自噬參與了FA引發(fā)的HT22細(xì)胞鐵死亡。5.H_2S(100、200、400μM,30 min)預(yù)處理后使能取消NCOA4與LC3B或FTH1共定位、GFP-LC3熒光斑增加、自噬相關(guān)蛋白LC3II/I上調(diào)和p62下調(diào)以及FTH1下降和NCOA4的上調(diào),表明H_2S可明顯拮抗FA誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞鐵自噬。6.H_2S(100、200、400μM,30 min)預(yù)處理能取消FA誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞死亡率增加、細(xì)胞內(nèi)GSH含量降低、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧、MDA、4-HNE和游離Fe~(2+)的含量增加,表明H_2S可拮抗FA誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞鐵死亡�！窘Y(jié)論】1.甲醛可通過促進(jìn)鐵自噬誘導(dǎo)HT22細(xì)胞鐵死亡;2.H_2S可抑制甲醛誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞鐵自噬-鐵死亡。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R741
【部分圖文】：

圖 3.1. FA 對(duì) HT22 細(xì)胞鐵死亡的影響Fig 3.1. Effect of FA on the Ferroptosis in HT22 cells. A, After HT22 cells wereexposed to FA（50, 100, 200 μM）for 24 h, the cell viability was measured by Trypanblue stain. B, The cell death was determined with flow cytometry after FITC/PIstaining. C, The cell lipid ROS was determined with flow cytometry after BODIPYTM581/591 C11 staining. The cellular GSH (D), MDA (E), and 4-HNE (F) levels weremeasured using Elisa kit. G, The content of cellular Fe2+was determined with flowcytometry after Ca-AM staining. Mean Fe2+fluorescence =(Mean Ca-AM+2,2′-BIPfluorescence) - Mean Ca-AM fluorescence. Values are the mean±S.E.M., n=3,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001, versus control group.3.2 DFO 對(duì) FA 誘導(dǎo) HT22 細(xì)胞鐵死亡的拮抗作用

圖 3.2. DFO 對(duì) FA 引起 HT22 細(xì)胞鐵死亡的影響Fig 3.2. Effect of DFO on FA-induced Ferroptosis in HT22 cells. Afterpretreatment with DFO (10 μM) for 30 min, HT22 cells were co-cultured with FA( 100 μM）for 24 h, A. The cell viability was measured by Trypan blue stain. B, Thecell death was determined with flow cytometry after FITC/PI staining. C, The the celllipid ROS was determined with flow cytometry after BODIPYTM581/591 C11staining.The cellular GSH (D), MDA (E), and 4-HNE (F) levels were measured usingElisa kit. G, The content of cellular Fe2+was determined with flow cytometry afterCa-AM staining. Mean Fe2+fluorescence =(Mean Ca-AM+2,2′-BIP fluorescence) -Mean Ca-AM fluorescence. Values are the mean±S.E.M., n=3,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001, versus control group,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001, versus FA-treatedalone group.

28圖 3.3. FA 對(duì) HT22 細(xì)胞鐵自噬的影響Fig 3.3. Effect of FA on the ferritinophagy in HT22 cells. A,B After HT22 cellswere exposed to FA（50, 100, 200 μM）for 24 h, the cellular distribution ofendogenous NCOA4, LC3B, and FTH1 was evaluated by confocal microscopy. Eachphotomicrograph represents 20× magnification of the distinct region of interest. C-E,HT22 cells expressing mRFP GFP LC3 were treated overnight with the indicatedcompounds, fixed and imaged by automated acquisition. Representative images of anoverlay of GFP (green) and mCherry (red) are shown with a scale bar equivalent to 10

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本文編號(hào)：2827015