背景腦血管病嚴(yán)重威脅人類健康,其中腦卒中是最常見的腦血管病。目前在我國(guó),因腦卒中導(dǎo)致的死亡已占死亡原因的首位,我國(guó)人口老齡化日益加劇,腦卒中必將成為威脅老年人健康的主要?dú)⑹帧ＤX卒中患者中缺血性腦卒中居多。缺血性腦卒中發(fā)生時(shí),腦組織缺血中心區(qū)神經(jīng)組織很快因缺血缺氧而發(fā)生不可挽回的梗死,但在缺血中心區(qū)周圍的缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)組織只是部分缺血缺氧,在一定時(shí)間內(nèi)只是處于病理損傷的早期階段,其中的神經(jīng)元多呈現(xiàn)細(xì)胞水樣變性,既有加重死亡的趨勢(shì),又有逆轉(zhuǎn)恢復(fù)正常的可能。因此,尋找神經(jīng)細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制,延長(zhǎng)半暗帶區(qū)細(xì)胞存活時(shí)間,適當(dāng)擴(kuò)大治療時(shí)間窗,為患者后續(xù)治療贏得時(shí)間是目前亟待解決的實(shí)際問題。近年來許多研究表明,自噬作為一種細(xì)胞自救機(jī)制,在生理和應(yīng)激條件下都發(fā)揮著重要作用。但缺血時(shí)自噬的作用機(jī)制不明確,發(fā)揮促進(jìn)存活還是加劇損傷作用也存在爭(zhēng)議。神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y作為體外細(xì)胞模型用來研究神經(jīng)元損傷是學(xué)術(shù)界公認(rèn)的,因此,本課題選用SH-SY5Y作為體外細(xì)胞模型,模擬缺血半暗帶的缺氧缺糖環(huán)境,通過觀察細(xì)胞微絲、線粒體變化,檢測(cè)細(xì)胞凋亡、壞死、自噬情況,全面反映神經(jīng)細(xì)胞的損傷變化,揭示神經(jīng)元自我救贖機(jī)制,為臨床上進(jìn)一步擴(kuò)大缺血性腦卒中治療時(shí)間窗、促進(jìn)康復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的研究在缺血缺氧條件下神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y的損傷情況,觀察Beclin1蛋白在缺血缺氧條件下對(duì)神經(jīng)元自噬的作用以及對(duì)細(xì)胞抗損傷的影響;觀察線粒體變化與神經(jīng)元自噬的關(guān)系以及在缺血缺氧致SH-SY5Y細(xì)胞損傷中的作用;觀察微絲變化與神經(jīng)元抗損傷活動(dòng)的關(guān)系,以期尋找影響神經(jīng)細(xì)胞自救的因素,為保護(hù)半暗帶神經(jīng)元提供依據(jù)。方法采用神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y進(jìn)行培養(yǎng),糖氧剝奪(OGD)模擬半暗帶區(qū)缺血缺氧環(huán)境,應(yīng)用RNA干擾(RNAi)技術(shù)構(gòu)建Beclin1-siRNA干擾模型,下調(diào)Beclin1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,從而下調(diào)自噬。觀察缺血缺氧對(duì)SH-SY5Y損傷的實(shí)驗(yàn),具體分為三組:對(duì)照組、OGD 6 h組、OGD 24 h組。觀察自噬在缺血缺氧SH-SY5Y損傷中的作用,具體實(shí)驗(yàn)分為四組:對(duì)照組、RNAi組、OGD 6 h組以及RNAi+OGD 6 h組。RT-PCR、Western Blot法對(duì)Beclin1-siRNA干擾模型進(jìn)行鑒定;采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力;微板比色法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(LDH)含量;特異性熒光探針標(biāo)記細(xì)胞微絲、線粒體,熒光顯微鏡下觀察微絲皮質(zhì)層、應(yīng)力纖維變化,線粒體分布、數(shù)量和形態(tài)改變;DCFH-DA熒光探針標(biāo)記活性氧(ROS),流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡觀察ROS變化;間接免疫熒光標(biāo)記LC3蛋白,Western Blot檢測(cè)Beclin1、LC3、P62自噬相關(guān)蛋白,評(píng)價(jià)細(xì)胞自噬情況;Hoechst33258/PI觀察細(xì)胞壞死情況;DAPI染色和Annexin V-FITC/PI分別觀察細(xì)胞核形態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平,Bcl-2、Bax凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況采用Western Blot檢測(cè)。結(jié)果1.缺血缺氧條件下神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y的變化與對(duì)照組相比隨OGD時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞的活力逐漸下降,LDH溢出逐漸增多;OGD 6 h組較對(duì)照組細(xì)胞微絲皮質(zhì)層變薄,應(yīng)力纖維減少,OGD 24 h后微絲損傷加重甚至出現(xiàn)凝集現(xiàn)象;線粒體總數(shù)減少,呈線狀的線粒體減少,呈點(diǎn)狀的線粒體增多,繞細(xì)胞核周分布;流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微鏡結(jié)果均顯示隨OGD時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)ROS水平逐漸升高;OGD處理后Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相對(duì)增多,反映自噬降解水平的P62表達(dá)下降,免疫熒光結(jié)果同樣顯示LC3-Ⅱ亮點(diǎn)增多,OGD后自噬水平上調(diào)且自噬流通暢;Hoechst33258/PI雙染結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比OGD后細(xì)胞呈現(xiàn)亮藍(lán)色、紅染,說明壞死細(xì)胞增多;凋亡方面,經(jīng)DAPI染色后OGD 6 h組的細(xì)胞核染色質(zhì)邊緣凝集,OGD 24 h后形態(tài)變化更加明顯,從整體上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率顯示OGD時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡率逐漸增加。2.Beclin1-siRNA轉(zhuǎn)染效果檢驗(yàn)Beclin1-siRNA干擾后基因水平和蛋白水平檢測(cè)均顯示,Beclin1水平明顯下調(diào),干擾成功。3.RNAi下調(diào)Beclin1水平缺血缺氧條件下SH-SY5Y的變化RNAi+OGD 6 h組與OGD 6 h組相比,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明顯減少,P62增多,自噬水平顯著下調(diào),但RNAi+OGD 6 h組自噬水平仍高于對(duì)照組;較OGD 6 h組,RNAi+OGD 6 h組細(xì)胞的活力下降明顯,線粒體數(shù)量減少,微絲皮質(zhì)層變薄,應(yīng)力纖維進(jìn)一步減少,壞死細(xì)胞增多,細(xì)胞凋亡率增加,Bax明顯增多,Bcl-2減少。結(jié)論缺血缺氧導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y發(fā)生損傷;Beclin1依賴的自噬對(duì)缺血缺氧神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y具有保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R743
【部分圖文】：

-1 OGD 不同時(shí)間對(duì) SH-SY5Y 細(xì)胞 LDH 溢出的培養(yǎng)上清液中 LDH 的含量；* P <0.05 與對(duì)照組對(duì)細(xì)胞微絲形態(tài)的影響常進(jìn)行都有賴于細(xì)胞骨架的完整性，而微的皮質(zhì)層、應(yīng)力纖維以及偽足，為細(xì)胞內(nèi)，微絲及微絲相關(guān)蛋白被氧化修飾，解聚圖 3-2 中所示，對(duì)照組皮質(zhì)層完整，細(xì)胞理 6 h 后 SH-SY5Y 細(xì)胞皮質(zhì)層變薄，應(yīng)層、應(yīng)力纖維進(jìn)一步減少，甚至消失。結(jié)破壞，神經(jīng)細(xì)胞 SH-SY5Y 損傷加劇。

圖 3-1 OGD 不同時(shí)間對(duì) SH-SY5Y 細(xì)胞 LDH 溢出的影響注：微板比色法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 LDH 的含量；* P <0.05 與對(duì)照組相比（n=3, x ± s）。3.1.3 缺血缺氧對(duì)細(xì)胞微絲形態(tài)的影響許多細(xì)胞活動(dòng)的正常進(jìn)行都有賴于細(xì)胞骨架的完整性，而微絲是細(xì)胞骨架的重要組成部分，用于形成細(xì)胞的皮質(zhì)層、應(yīng)力纖維以及偽足，為細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸提供動(dòng)力和交通線路。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，微絲及微絲相關(guān)蛋白被氧化修飾，解聚與聚合平衡打破，微絲結(jié)構(gòu)和功能被破壞。如圖 3-2 中所示，對(duì)照組皮質(zhì)層完整，細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力纖維彌散分布，與之相比，經(jīng) OGD 處理 6 h 后 SH-SY5Y 細(xì)胞皮質(zhì)層變薄，應(yīng)力纖維減少，OGD 處理24 h 后微絲凝集，皮質(zhì)層、應(yīng)力纖維進(jìn)一步減少，甚至消失。結(jié)果表明，隨著缺血缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞微絲被破壞，神經(jīng)細(xì)胞 SH-SY5Y 損傷加劇。

因此檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體的狀態(tài)在一定程度上反映了細(xì)胞的損傷情況。采用不依賴于線粒體膜電位的活細(xì)胞線粒體特異性熒光染料進(jìn)行染色，如圖 3-3 所示，綠色熒光即為線粒體，由圖中可以看到，對(duì)照組線粒體在細(xì)胞質(zhì)彌散分布，多呈線狀；經(jīng) OGD處理 6 h 的神經(jīng)細(xì)胞 SH-SY5Y 綠色熒光減少，呈現(xiàn)繞核分布，多為點(diǎn)狀，處理 24 h 后綠色熒光進(jìn)一步減少，核周分布更加明顯。結(jié)果顯示，隨著缺血缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，線粒體數(shù)量減少，分離增多，細(xì)胞發(fā)生損傷。

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