研究背景在全球缺血性腦卒中患者中,大約25%由腦小血管疾病(cerebral small vessel disease,SVD)引起。在60歲以上人群中,超過50%患有腦小血管病。SVD累及的血管直徑為30-800 μm,包括發(fā)生于小動脈、微動脈、毛細(xì)血管和小靜脈的疾病。SVD以缺血性或出血性腦卒中和癡呆為特征,并可導(dǎo)致認(rèn)知功能、步態(tài)和平衡能力的顯著異常。在腦小血管疾病中,有大約5%為遺傳性。其中,伴有皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈病(Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy,CADASIL)為最常見的單基因遺傳性腦小血管病。盡管全球發(fā)病率未知,在英國,約每10萬人中有4.15例患者,10.7名致病突變基因攜帶者,由于散發(fā)型患者的存在,實際患病率可能更高。經(jīng)報道,CADASIL在65歲以下腔隙性梗死伴白質(zhì)疏松的患者中占2%,在50歲以下患者中占11%。CADASIL是成年人中腦卒中與血管性癡呆的首要原因,以成年起病的先兆偏頭痛,反復(fù)發(fā)作的皮質(zhì)下腦缺血發(fā)作(transient ischemic attacks,TIA)或腦卒中,進(jìn)行性認(rèn)知損害以及精神障礙為主要特征。其中偏頭痛與腦卒中通常為典型首發(fā)癥狀。然而CADASIL的臨床表現(xiàn)在家族之間甚至家族內(nèi)部都有較大差異,這些臨床表現(xiàn)在不同年齡與不同病程中出現(xiàn)頻率也有所不同。CADASIL的平均發(fā)病年齡為41歲(±9.2年),平均死亡年齡約為65歲,根據(jù)表型不同可早至30歲晚至80歲。CADASIL的典型的核磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)異常表現(xiàn)包括腔隙性梗死,擴大的血管間隙以及T2加權(quán)像腦白質(zhì)的對稱性高信號。其中,T2加權(quán)像的白質(zhì)高信號最為常見,通常位于腦室周圍以及白質(zhì)深部,發(fā)生率與嚴(yán)重程度隨年齡增長而顯著增加。位于前顳葉、外囊的白質(zhì)高信號可使CADASIL與散發(fā)型腦小血管病相鑒別。CADASIL影像學(xué)異常表現(xiàn)可早至20歲被檢測到,致病突變基因攜帶者在35歲之后均有MRI異常表現(xiàn)。目前CADASIL治療選擇十分有限,包括對癥治療與二級預(yù)防措施。有文獻(xiàn)表明SVD危險因素可能加速CADASIL癥狀進(jìn)展,應(yīng)該及時進(jìn)行控制。CADASIL主要由位于染色體19p13.1上的Notch3基因突變引起。Notch3基因在全身小動脈平滑肌細(xì)胞(arterial smooth muscle cells,VSMCs)以及毛細(xì)血管周皮細(xì)胞中表達(dá),,而只有腦血管病變引起臨床癥狀。Notch3基因缺陷主要導(dǎo)致異常的動脈結(jié)構(gòu)以及肌源性反應(yīng)。其對血管的損傷主要以血管平滑肌細(xì)胞變性與減少,細(xì)胞外嗜鋨樣物質(zhì)沉積,Notch3受體蛋白胞外段異常聚集,細(xì)胞外基質(zhì)聚集導(dǎo)致纖維化為特征。Notch3編碼單次跨膜的異二聚體受體,由34個表皮生長因子樣重復(fù)序列(epidermal growth fac tor-l ike repeats,EGF-like repeats)組成的胞外段(extracellular domain,ECD),跨膜結(jié)構(gòu)域,以及胞內(nèi)段構(gòu)成。每個EGF-like結(jié)構(gòu)域包括6個高度保守的半胱氨酸殘基,在Cl-C3,C2-C4和C5-C6半胱氨酸之間形成分子內(nèi)二硫鍵,這種結(jié)構(gòu)對于與配體結(jié)合來說至關(guān)重要。Notch3首先合成280kDa的前體形式,隨后被furin成對堿性氨基酸蛋白酶通過SI蛋白水解作用形成細(xì)胞膜上的異二聚體受體。當(dāng)Notch3受體與DSL(Delta/Serrate/Lag-2)配體相結(jié)合后,金屬蛋白水解酶ADAM對其進(jìn)行S2蛋白水解,使異二聚體釋放210kDa的胞外段。脫落的胞外段隨后被DSL配體細(xì)胞或原本的信號接收細(xì)胞所內(nèi)吞。然后再在γ分泌酶(γ-secretase)的S3蛋白水解切割作用下,Notch3的胞內(nèi)段釋放,并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),調(diào)控靶基因表達(dá)。迄今為止,Notch3基因上的的CADASIL致病突變已有超過300個突變位點被記錄報道。絕大部分位于全部33個外顯子中編碼34個EGF樣重復(fù)序列的2-24號外顯子。95%的致病突變?yōu)殄e義突變,通常導(dǎo)致Notch3的半胱氨酸數(shù)目發(fā)生變化,個數(shù)增加或減少成為奇數(shù),從而引起Notch3蛋白胞外域結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,錯誤折疊并聚集。這種異常二硫鍵的形成先前被認(rèn)為影響與配體結(jié)合從而影響信號傳導(dǎo),然而對信號傳導(dǎo)病理機制的研究結(jié)論不一,許多致病突變被發(fā)現(xiàn)并不影響Notch3信號傳導(dǎo)。另外,在Notch3基因敲除小鼠中,Notch3的完全喪失并不會引起CADASIL的病理變化。這表明CADASIL的致病突變可能并不是損害原本Notch3的基本功能,而可能是新產(chǎn)生了細(xì)胞毒性作用。類似淀粉樣沉淀炎性斑塊在阿爾茨海默病中的致病作用機理,Notch3的胞外段異常聚集也被認(rèn)為是CADASIL中的主要病理機制。研究者們發(fā)現(xiàn)了許多支持證據(jù)。首先,在CADASIL患者和轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi),Notch3的胞外段異常沉積發(fā)生在其他病理改變之前。另外,研究表明,突變型的Notch3相較于野生型的Notch3,有更易形成聚集體的傾向,并且更加不易降解。先前研究者通過體外培養(yǎng)CADASIL患者的平滑肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了與蛋白降解與折疊相關(guān)蛋白的表達(dá)水平異常,表明了突變型Notch3可能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并激活未折疊蛋白反應(yīng)。另一相關(guān)體外實驗觀察到,突變型Notch3聚集體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的異常滯留導(dǎo)致細(xì)胞生長減少,并對蛋白酶體抑制等細(xì)胞壓力更加敏感,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這些研究表明,致病突變引起Notch3的錯誤折疊以及多聚化。到目前為止,一些非半胱氨酸的CADASIL致病突變也被陸續(xù)報道,并有研究發(fā)現(xiàn)一些非半胱氨酸型的致病突變與半胱氨酸型的致病突變類似,也可引起Notch3的結(jié)構(gòu)改變。并且,一些非半胱氨酸型的致病突變也同樣有Notch3蛋白聚集傾向。我們于臨床收治了一名具有CADASIL典型臨床表現(xiàn)的患者,具體表現(xiàn)為青年起病的反復(fù)偏頭痛發(fā)作,多次腔隙性梗死,抑郁和焦慮障礙,以及與病情嚴(yán)重程度不相符的心血管危險因素如糖耐量異常與高血壓1級。MRI表現(xiàn)為T2加權(quán)像下彌漫性雙側(cè)對稱腦白質(zhì)深部高信號,以及白質(zhì)高信號區(qū)、基底節(jié)與腦干的多發(fā)腔隙性梗死。行NOTCH3全外顯子基因篩查時發(fā)現(xiàn)c.218GC雜合突變,該位點未經(jīng)報導(dǎo)。此突變致使73位氨基酸的甘氨酸變?yōu)楸彼?p.G73A),我們擬就該突變位點進(jìn)行體外探究實驗以證實其致病性。研究目的本研究主要探討了 CADASIL的發(fā)病機理,明確新發(fā)現(xiàn)的CADASIL相關(guān)c.218GC NOTCH3基因突變的致病性。研究方法1.p.G73A的分子遺傳學(xué)分析1.1對Notch3第73位氨基酸進(jìn)行分子內(nèi)EGF樣重復(fù)序列間的遺傳保守性分析。1.2對Notch3第73位氨基酸進(jìn)行物種間進(jìn)化保守性分析。2.準(zhǔn)備野生型Notch3EKD表達(dá)質(zhì)粒和c.218GC突變型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒2.1于addgene購買Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)行質(zhì)粒擴增純化,及測序驗證。2.2對Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行單位點誘導(dǎo)突變,進(jìn)行質(zhì)粒擴增并測序驗證。3.探索Notch3ECD在HEK293T細(xì)胞的表達(dá)分布3.1利用野生型Notch3ECD與突變型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒對HEK293T細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。3.2培養(yǎng)48h后,Notch3ECD特異性鼠單克隆抗體4℃孵育過夜,Alexa Fluor 488熒光二抗室溫孵育lh,在共聚焦顯微鏡下觀察過表達(dá)的Notch3ECD在細(xì)胞中分布。4.探究p.G73A突變型Notch3ECD對HEK293T細(xì)胞活力的影響4.1 HEK293T細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染野生型Notch3ECD與突變型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒以及陰性對照質(zhì)粒pcDNA4,培養(yǎng)48h后進(jìn)行CCK8實驗4.2 HEK293T細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染野生型Notch3ECD與突變型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒以及陰性對照質(zhì)粒pcDNA4,培養(yǎng)48h后進(jìn)行ATP發(fā)光法細(xì)胞活力檢測實驗5.探究p.G73A突變型Notch3ECD對細(xì)胞凋亡的影響HEK293T細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染野生型Notch3ECD與突變型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒以及pcDNA4陰性對照質(zhì)粒,培養(yǎng)48h后對其進(jìn)行annexinV-FITC/PI雙染,利用流式細(xì)胞學(xué)實驗檢測每組凋亡率。研究結(jié)果1.Notch3第73位甘氨酸在分子內(nèi)EGF樣重復(fù)序列間具有保守性。在Notch3 34個EGF樣重復(fù)序列中,除第17個EGF樣結(jié)構(gòu)域外,都呈高度保守。2.Notch3第73位甘氨酸在物種間具有高度進(jìn)化保守性。Notch3第73位氨基酸在Notch3二硫鍵環(huán)中的位置在非人靈長類、嚙齒類動物至魚類中都具有高度進(jìn)化保守性。在人和嚙齒類動物中位于C5-C6二硫鍵環(huán)之間,在其余的物種位于唯一的EGF-1 ike結(jié)構(gòu)域中。3.p.G73A突變型Notch3ECD可降低HEK293T細(xì)胞活力3.1在CCK8實驗中,轉(zhuǎn)染了突變型Notch3HEKD表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞較陰性對照組細(xì)胞活力明顯降低。轉(zhuǎn)染了野生型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞較陰性對照組細(xì)胞活力無明顯變化。3.2在ATP細(xì)胞活力檢測實驗中,轉(zhuǎn)染了突變型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞較陰性對照組細(xì)胞活力明顯降低。轉(zhuǎn)染了野生型Notch3ECD)表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞較陰性對照組細(xì)胞活力無明顯變化。4.p.G73A突變型Notch3ECD促進(jìn)HEK293T細(xì)胞凋亡annexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞學(xué)實驗結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染了突變型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞較陰性對照組細(xì)胞凋亡率明顯增加。轉(zhuǎn)染了野生型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞較陰性對照組細(xì)胞凋亡率無明顯變化。結(jié)論1.Notch3第73位甘氨酸在分子內(nèi)EGF樣重復(fù)序列間以及物種間具有高度遺傳保守性。2.p.G73A突變型Notch3ECD可通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡影響細(xì)胞活力。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R743
【部分圖文】：

圖１．１．２邋ＮＯＴＣＨ３的ＥＧＦ重復(fù)序列間對比。方框所示為Ｇｌｙ７３在各個ＥＧＦ結(jié)構(gòu)逡逑域的對應(yīng)位點。逡逑１．２邋ＮＯＴＣＨ３第７３位甘氨酸在不同物種間的保守性分析逡逑接著我們又研究了該位點在不同物種間的保守性。我們利用Ｊａｌｖｉｅｗ軟件分逡逑析了各個物種的第一邋ＥＧＦ結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)序列。研究發(fā)現(xiàn)，該位點從靈長類、嚙逡逑齒類到兩棲類乃至魚類都呈現(xiàn)出高度進(jìn)化保守性。該位點在人類，小鼠與大鼠中逡逑位于Ｃ５－Ｃ６半胱氨酸二硫鍵環(huán)之間，在其余物種則位于第一邋ＥＧＦ結(jié)構(gòu)域唯一的二逡逑硫鍵環(huán)之間（圖１．１．３邋）。各物種Ｎ０ＴＣＨ３序列均來自Ｕｎｉｐｒｏｔ數(shù)據(jù)庫逡逑（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）逡逑

逑結(jié)構(gòu)域間的位點保守性。我們發(fā)現(xiàn)，除了第１７個ＥＧＦ結(jié)構(gòu)域外，該位點在其余逡逑所有ＥＧＦ結(jié)構(gòu)域都高度保守（圖１．１．２）。逡逑，邐ｃ邐ｌｏｏｐ邋——，逡逑Ｃ４－Ｃ６邋ｉｎ邋ＥＧＦ－ｌｉｋｅ邋ｒｅｐｅａｔｓ邋ｏｆ邋Ｈｕｍａｎ邋Ｎ０ＴＣＨ３邋ＡＣ４ＬＣ５ＰＰＧＷ邋Ｖ｜ｇ｜Ｅ邋Ｒ邋Ｃ邋６邋Ｑ邋Ｌ邋Ｅ邋Ｄ逡逑ＥＧＦ－ｌｉｋｅ邋Ｄｏｍａｉｎ邋１－５，７－１６，１８－２４，２６－３１，３３－３４邐＊Ｃ４＊Ｃ５＊＊Ｇ邐l:l:邋Ｇ＊＊Ｃ６＊＊＊＊逡逑ＥＧＦ－ｌｉｋｅ邋Ｄｏｍａｉｎ邋１７邐＊邋Ｃ邋４邋＊邋Ｃ邋５邋＊邐＊邋Ｇ邐＊邋＊邋＊邋＊邋＊邋Ｃ邋６邋＊邋＊邋＊邋＊逡逑ＥＧＦ－ｌｉｋｅ邋Ｄｏｍａｉｎ邋６，２５，３２邐＊Ｃ４＊Ｃ５＊邐l:l:邐l:l:邋Ｃ６＊＊＊＊逡逑圖１．１．２邋ＮＯＴＣＨ３的ＥＧＦ重復(fù)序列間對比。方框所示為Ｇｌｙ７３在各個ＥＧＦ結(jié)構(gòu)逡逑域的對應(yīng)位點。逡逑１．２邋ＮＯＴＣＨ３第７３位甘氨酸在不同物種間的保守性分析逡逑接著我們又研究了該位點在不同物種間的保守性。我們利用Ｊａｌｖｉｅｗ軟件分逡逑析了各個物種的第一邋ＥＧＦ結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)序列。研究發(fā)現(xiàn)，該位點從靈長類、嚙逡逑齒類到兩棲類乃至魚類都呈現(xiàn)出高度進(jìn)化保守性。該位點在人類，小鼠與大鼠中逡逑位于Ｃ５－Ｃ６半胱氨酸二硫鍵環(huán)之間，在其余物種則位于第一邋ＥＧＦ結(jié)構(gòu)域唯一的二逡逑硫鍵環(huán)之間（圖１．１．３邋

ｐＧ７３Ａ－ＮＯＴＣＨ３－ｂｉｏ－Ｈｉｓ邋分別轉(zhuǎn)染邋ＨＥＫ２９３Ｔ邋細(xì)胞，４８ｈ邋后用邋ＮＯＴＣＨ３邋特異性抗逡逑體作為一抗，Ａｌｅｘａ邋Ｆｌｕｏｒ邋４８８作為二抗進(jìn)行孵育，用１０ｘ６３的高靈敏度激光共聚逡逑焦顯微鏡進(jìn)行觀察。如圖３所示，Ｎ０ＴＣＨｅｃｄ主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。相較野生型，逡逑Ｇ７３Ａ在核周有顆粒樣的密集分布，而野生型相比而言分布較均勻。逡逑２９逡逑

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本文編號：2822396