發(fā)布時(shí)間：2020-09-19 10:29

　　 研究背景在全球缺血性腦卒中患者中,大約25%由腦小血管疾病(cerebral small vessel disease,SVD)引起。在60歲以上人群中,超過(guò)50%患有腦小血管病。SVD累及的血管直徑為30-800 μm,包括發(fā)生于小動(dòng)脈、微動(dòng)脈、毛細(xì)血管和小靜脈的疾病。SVD以缺血性或出血性腦卒中和癡呆為特征,并可導(dǎo)致認(rèn)知功能、步態(tài)和平衡能力的顯著異常。在腦小血管疾病中,有大約5%為遺傳性。其中,伴有皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病(Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy,CADASIL)為最常見(jiàn)的單基因遺傳性腦小血管病。盡管全球發(fā)病率未知,在英國(guó),約每10萬(wàn)人中有4.15例患者,10.7名致病突變基因攜帶者,由于散發(fā)型患者的存在,實(shí)際患病率可能更高。經(jīng)報(bào)道,CADASIL在65歲以下腔隙性梗死伴白質(zhì)疏松的患者中占2%,在50歲以下患者中占11%。CADASIL是成年人中腦卒中與血管性癡呆的首要原因,以成年起病的先兆偏頭痛,反復(fù)發(fā)作的皮質(zhì)下腦缺血發(fā)作(transient ischemic attacks,TIA)或腦卒中,進(jìn)行性認(rèn)知損害以及精神障礙為主要特征。其中偏頭痛與腦卒中通常為典型首發(fā)癥狀。然而CADASIL的臨床表現(xiàn)在家族之間甚至家族內(nèi)部都有較大差異,這些臨床表現(xiàn)在不同年齡與不同病程中出現(xiàn)頻率也有所不同。CADASIL的平均發(fā)病年齡為41歲(±9.2年),平均死亡年齡約為65歲,根據(jù)表型不同可早至30歲晚至80歲。CADASIL的典型的核磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)異常表現(xiàn)包括腔隙性梗死,擴(kuò)大的血管間隙以及T2加權(quán)像腦白質(zhì)的對(duì)稱性高信號(hào)。其中,T2加權(quán)像的白質(zhì)高信號(hào)最為常見(jiàn),通常位于腦室周?chē)约鞍踪|(zhì)深部,發(fā)生率與嚴(yán)重程度隨年齡增長(zhǎng)而顯著增加。位于前顳葉、外囊的白質(zhì)高信號(hào)可使CADASIL與散發(fā)型腦小血管病相鑒別。CADASIL影像學(xué)異常表現(xiàn)可早至20歲被檢測(cè)到,致病突變基因攜帶者在35歲之后均有MRI異常表現(xiàn)。目前CADASIL治療選擇十分有限,包括對(duì)癥治療與二級(jí)預(yù)防措施。有文獻(xiàn)表明SVD危險(xiǎn)因素可能加速CADASIL癥狀進(jìn)展,應(yīng)該及時(shí)進(jìn)行控制。CADASIL主要由位于染色體19p13.1上的Notch3基因突變引起。Notch3基因在全身小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(arterial smooth muscle cells,VSMCs)以及毛細(xì)血管周皮細(xì)胞中表達(dá),,而只有腦血管病變引起臨床癥狀。Notch3基因缺陷主要導(dǎo)致異常的動(dòng)脈結(jié)構(gòu)以及肌源性反應(yīng)。其對(duì)血管的損傷主要以血管平滑肌細(xì)胞變性與減少,細(xì)胞外嗜鋨樣物質(zhì)沉積,Notch3受體蛋白胞外段異常聚集,細(xì)胞外基質(zhì)聚集導(dǎo)致纖維化為特征。Notch3編碼單次跨膜的異二聚體受體,由34個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)序列(epidermal growth fac tor-l ike repeats,EGF-like repeats)組成的胞外段(extracellular domain,ECD),跨膜結(jié)構(gòu)域,以及胞內(nèi)段構(gòu)成。每個(gè)EGF-like結(jié)構(gòu)域包括6個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基,在Cl-C3,C2-C4和C5-C6半胱氨酸之間形成分子內(nèi)二硫鍵,這種結(jié)構(gòu)對(duì)于與配體結(jié)合來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。Notch3首先合成280kDa的前體形式,隨后被furin成對(duì)堿性氨基酸蛋白酶通過(guò)SI蛋白水解作用形成細(xì)胞膜上的異二聚體受體。當(dāng)Notch3受體與DSL(Delta/Serrate/Lag-2)配體相結(jié)合后,金屬蛋白水解酶ADAM對(duì)其進(jìn)行S2蛋白水解,使異二聚體釋放210kDa的胞外段。脫落的胞外段隨后被DSL配體細(xì)胞或原本的信號(hào)接收細(xì)胞所內(nèi)吞。然后再在γ分泌酶(γ-secretase)的S3蛋白水解切割作用下,Notch3的胞內(nèi)段釋放,并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),調(diào)控靶基因表達(dá)。迄今為止,Notch3基因上的的CADASIL致病突變已有超過(guò)300個(gè)突變位點(diǎn)被記錄報(bào)道。絕大部分位于全部33個(gè)外顯子中編碼34個(gè)EGF樣重復(fù)序列的2-24號(hào)外顯子。95%的致病突變?yōu)殄e(cuò)義突變,通常導(dǎo)致Notch3的半胱氨酸數(shù)目發(fā)生變化,個(gè)數(shù)增加或減少成為奇數(shù),從而引起Notch3蛋白胞外域結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,錯(cuò)誤折疊并聚集。這種異常二硫鍵的形成先前被認(rèn)為影響與配體結(jié)合從而影響信號(hào)傳導(dǎo),然而對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)病理機(jī)制的研究結(jié)論不一,許多致病突變被發(fā)現(xiàn)并不影響Notch3信號(hào)傳導(dǎo)。另外,在Notch3基因敲除小鼠中,Notch3的完全喪失并不會(huì)引起CADASIL的病理變化。這表明CADASIL的致病突變可能并不是損害原本Notch3的基本功能,而可能是新產(chǎn)生了細(xì)胞毒性作用。類(lèi)似淀粉樣沉淀炎性斑塊在阿爾茨海默病中的致病作用機(jī)理,Notch3的胞外段異常聚集也被認(rèn)為是CADASIL中的主要病理機(jī)制。研究者們發(fā)現(xiàn)了許多支持證據(jù)。首先,在CADASIL患者和轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi),Notch3的胞外段異常沉積發(fā)生在其他病理改變之前。另外,研究表明,突變型的Notch3相較于野生型的Notch3,有更易形成聚集體的傾向,并且更加不易降解。先前研究者通過(guò)體外培養(yǎng)CADASIL患者的平滑肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了與蛋白降解與折疊相關(guān)蛋白的表達(dá)水平異常,表明了突變型Notch3可能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并激活未折疊蛋白反應(yīng)。另一相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)觀察到,突變型Notch3聚集體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的異常滯留導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)減少,并對(duì)蛋白酶體抑制等細(xì)胞壓力更加敏感,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這些研究表明,致病突變引起Notch3的錯(cuò)誤折疊以及多聚化。到目前為止,一些非半胱氨酸的CADASIL致病突變也被陸續(xù)報(bào)道,并有研究發(fā)現(xiàn)一些非半胱氨酸型的致病突變與半胱氨酸型的致病突變類(lèi)似,也可引起Notch3的結(jié)構(gòu)改變。并且,一些非半胱氨酸型的致病突變也同樣有Notch3蛋白聚集傾向。我們于臨床收治了一名具有CADASIL典型臨床表現(xiàn)的患者,具體表現(xiàn)為青年起病的反復(fù)偏頭痛發(fā)作,多次腔隙性梗死,抑郁和焦慮障礙,以及與病情嚴(yán)重程度不相符的心血管危險(xiǎn)因素如糖耐量異常與高血壓1級(jí)。MRI表現(xiàn)為T(mén)2加權(quán)像下彌漫性雙側(cè)對(duì)稱腦白質(zhì)深部高信號(hào),以及白質(zhì)高信號(hào)區(qū)、基底節(jié)與腦干的多發(fā)腔隙性梗死。行NOTCH3全外顯子基因篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)c.218GC雜合突變,該位點(diǎn)未經(jīng)報(bào)導(dǎo)。此突變致使73位氨基酸的甘氨酸變?yōu)楸彼?p.G73A),我們擬就該突變位點(diǎn)進(jìn)行體外探究實(shí)驗(yàn)以證實(shí)其致病性。研究目的本研究主要探討了 CADASIL的發(fā)病機(jī)理,明確新發(fā)現(xiàn)的CADASIL相關(guān)c.218GC NOTCH3基因突變的致病性。研究方法1.p.G73A的分子遺傳學(xué)分析1.1對(duì)Notch3第73位氨基酸進(jìn)行分子內(nèi)EGF樣重復(fù)序列間的遺傳保守性分析。1.2對(duì)Notch3第73位氨基酸進(jìn)行物種間進(jìn)化保守性分析。2.準(zhǔn)備野生型Notch3EKD表達(dá)質(zhì)粒和c.218GC突變型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒2.1于addgene購(gòu)買(mǎi)Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增純化,及測(cè)序驗(yàn)證。2.2對(duì)Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行單位點(diǎn)誘導(dǎo)突變,進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證。3.探索Notch3ECD在HEK293T細(xì)胞的表達(dá)分布3.1利用野生型Notch3ECD與突變型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒對(duì)HEK293T細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。3.2培養(yǎng)48h后,Notch3ECD特異性鼠單克隆抗體4℃孵育過(guò)夜,Alexa Fluor 488熒光二抗室溫孵育lh,在共聚焦顯微鏡下觀察過(guò)表達(dá)的Notch3ECD在細(xì)胞中分布。4.探究p.G73A突變型Notch3ECD對(duì)HEK293T細(xì)胞活力的影響4.1 HEK293T細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染野生型Notch3ECD與突變型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒以及陰性對(duì)照質(zhì)粒pcDNA4,培養(yǎng)48h后進(jìn)行CCK8實(shí)驗(yàn)4.2 HEK293T細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染野生型Notch3ECD與突變型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒以及陰性對(duì)照質(zhì)粒pcDNA4,培養(yǎng)48h后進(jìn)行ATP發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)5.探究p.G73A突變型Notch3ECD對(duì)細(xì)胞凋亡的影響HEK293T細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染野生型Notch3ECD與突變型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒以及pcDNA4陰性對(duì)照質(zhì)粒,培養(yǎng)48h后對(duì)其進(jìn)行annexinV-FITC/PI雙染,利用流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)每組凋亡率。研究結(jié)果1.Notch3第73位甘氨酸在分子內(nèi)EGF樣重復(fù)序列間具有保守性。在Notch3 34個(gè)EGF樣重復(fù)序列中,除第17個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域外,都呈高度保守。2.Notch3第73位甘氨酸在物種間具有高度進(jìn)化保守性。Notch3第73位氨基酸在Notch3二硫鍵環(huán)中的位置在非人靈長(zhǎng)類(lèi)、嚙齒類(lèi)動(dòng)物至魚(yú)類(lèi)中都具有高度進(jìn)化保守性。在人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物中位于C5-C6二硫鍵環(huán)之間,在其余的物種位于唯一的EGF-1 ike結(jié)構(gòu)域中。3.p.G73A突變型Notch3ECD可降低HEK293T細(xì)胞活力3.1在CCK8實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染了突變型Notch3HEKD表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞較陰性對(duì)照組細(xì)胞活力明顯降低。轉(zhuǎn)染了野生型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞較陰性對(duì)照組細(xì)胞活力無(wú)明顯變化。3.2在ATP細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染了突變型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞較陰性對(duì)照組細(xì)胞活力明顯降低。轉(zhuǎn)染了野生型Notch3ECD)表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞較陰性對(duì)照組細(xì)胞活力無(wú)明顯變化。4.p.G73A突變型Notch3ECD促進(jìn)HEK293T細(xì)胞凋亡annexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染了突變型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞較陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率明顯增加。轉(zhuǎn)染了野生型Notch3ECD表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞較陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化。結(jié)論1.Notch3第73位甘氨酸在分子內(nèi)EGF樣重復(fù)序列間以及物種間具有高度遺傳保守性。2.p.G73A突變型Notch3ECD可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡影響細(xì)胞活力。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R743
【部分圖文】：

圖１．１．２邋ＮＯＴＣＨ３的ＥＧＦ重復(fù)序列間對(duì)比。方框所示為Ｇｌｙ７３在各個(gè)ＥＧＦ結(jié)構(gòu)逡逑域的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)。逡逑１．２邋ＮＯＴＣＨ３第７３位甘氨酸在不同物種間的保守性分析逡逑接著我們又研究了該位點(diǎn)在不同物種間的保守性。我們利用Ｊａｌｖｉｅｗ軟件分逡逑析了各個(gè)物種的第一邋ＥＧＦ結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)序列。研究發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)從靈長(zhǎng)類(lèi)、嚙逡逑齒類(lèi)到兩棲類(lèi)乃至魚(yú)類(lèi)都呈現(xiàn)出高度進(jìn)化保守性。該位點(diǎn)在人類(lèi)，小鼠與大鼠中逡逑位于Ｃ５－Ｃ６半胱氨酸二硫鍵環(huán)之間，在其余物種則位于第一邋ＥＧＦ結(jié)構(gòu)域唯一的二逡逑硫鍵環(huán)之間（圖１．１．３邋）。各物種Ｎ０ＴＣＨ３序列均來(lái)自Ｕｎｉｐｒｏｔ數(shù)據(jù)庫(kù)逡逑（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）逡逑

逑結(jié)構(gòu)域間的位點(diǎn)保守性。我們發(fā)現(xiàn)，除了第１７個(gè)ＥＧＦ結(jié)構(gòu)域外，該位點(diǎn)在其余逡逑所有ＥＧＦ結(jié)構(gòu)域都高度保守（圖１．１．２）。逡逑，邐ｃ邐ｌｏｏｐ邋——，逡逑Ｃ４－Ｃ６邋ｉｎ邋ＥＧＦ－ｌｉｋｅ邋ｒｅｐｅａｔｓ邋ｏｆ邋Ｈｕｍａｎ邋Ｎ０ＴＣＨ３邋ＡＣ４ＬＣ５ＰＰＧＷ邋Ｖ｜ｇ｜Ｅ邋Ｒ邋Ｃ邋６邋Ｑ邋Ｌ邋Ｅ邋Ｄ逡逑ＥＧＦ－ｌｉｋｅ邋Ｄｏｍａｉｎ邋１－５，７－１６，１８－２４，２６－３１，３３－３４邐＊Ｃ４＊Ｃ５＊＊Ｇ邐l:l:邋Ｇ＊＊Ｃ６＊＊＊＊逡逑ＥＧＦ－ｌｉｋｅ邋Ｄｏｍａｉｎ邋１７邐＊邋Ｃ邋４邋＊邋Ｃ邋５邋＊邐＊邋Ｇ邐＊邋＊邋＊邋＊邋＊邋Ｃ邋６邋＊邋＊邋＊邋＊逡逑ＥＧＦ－ｌｉｋｅ邋Ｄｏｍａｉｎ邋６，２５，３２邐＊Ｃ４＊Ｃ５＊邐l:l:邐l:l:邋Ｃ６＊＊＊＊逡逑圖１．１．２邋ＮＯＴＣＨ３的ＥＧＦ重復(fù)序列間對(duì)比。方框所示為Ｇｌｙ７３在各個(gè)ＥＧＦ結(jié)構(gòu)逡逑域的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)。逡逑１．２邋ＮＯＴＣＨ３第７３位甘氨酸在不同物種間的保守性分析逡逑接著我們又研究了該位點(diǎn)在不同物種間的保守性。我們利用Ｊａｌｖｉｅｗ軟件分逡逑析了各個(gè)物種的第一邋ＥＧＦ結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)序列。研究發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)從靈長(zhǎng)類(lèi)、嚙逡逑齒類(lèi)到兩棲類(lèi)乃至魚(yú)類(lèi)都呈現(xiàn)出高度進(jìn)化保守性。該位點(diǎn)在人類(lèi)，小鼠與大鼠中逡逑位于Ｃ５－Ｃ６半胱氨酸二硫鍵環(huán)之間，在其余物種則位于第一邋ＥＧＦ結(jié)構(gòu)域唯一的二逡逑硫鍵環(huán)之間（圖１．１．３邋

ｐＧ７３Ａ－ＮＯＴＣＨ３－ｂｉｏ－Ｈｉｓ邋分別轉(zhuǎn)染邋ＨＥＫ２９３Ｔ邋細(xì)胞，４８ｈ邋后用邋ＮＯＴＣＨ３邋特異性抗逡逑體作為一抗，Ａｌｅｘａ邋Ｆｌｕｏｒ邋４８８作為二抗進(jìn)行孵育，用１０ｘ６３的高靈敏度激光共聚逡逑焦顯微鏡進(jìn)行觀察。如圖３所示，Ｎ０ＴＣＨｅｃｄ主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。相較野生型，逡逑Ｇ７３Ａ在核周有顆粒樣的密集分布，而野生型相比而言分布較均勻。逡逑２９逡逑

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10 彭功玲;田野;逯

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