癲癇是一種常見的神經(jīng)性疾病,以反復(fù)的、自發(fā)的癲癇發(fā)作為臨床特征。癲癇發(fā)作是由大腦皮層神經(jīng)元的超同步異常放電導(dǎo)致腦功能暫時(shí)性紊亂的一種現(xiàn)象。癲癇具有很高的發(fā)病率和致死率,然而癲癇的病因和發(fā)病機(jī)理還不是很清楚�？赡軐�(dǎo)致癲癇的病因有很多,比如遺傳因素、后天獲得因素以及刺激因素等等。單基因突變可以導(dǎo)致特發(fā)性癲癇,而這些單基因中有很大一部分是編碼離子通道的基因,其中包括電壓門控型的鉀離子通道、鈉離子通道和鈣離子通道,還有煙堿型乙酰膽堿受體和GABAA型受體等等。之前,我們實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了KCNMA1基因上的一個(gè)突變p.D434G可以導(dǎo)致全身性癲癇和陣發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙(GEPD),第一次把KCNMA1基因和癲癇關(guān)聯(lián)了起來(lái)。KCNMA1基因編碼的BK通道是一種可以同時(shí)被鈣離子和電壓激活的大電導(dǎo)鉀離子通道。BK通道廣泛表達(dá)于機(jī)體的各種組織和細(xì)胞中,參與了許多重要的生理過程,比如神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,平滑肌的收縮和耳蝸毛細(xì)胞的調(diào)諧等等。BK通道的電壓敏感器位于S4跨膜片段,鈣離子敏感位點(diǎn)存在于胞質(zhì)內(nèi)的兩個(gè)RCK結(jié)構(gòu)域中。p.D434G突變導(dǎo)致GEPD的分子機(jī)制是,它通過提高BK通道的鈣離子敏感性進(jìn)而增強(qiáng)了通道的激活特性。本次研究中,我們一共收集到了四個(gè)KCNMA1基因的突變,c.2984AG(p.N995S)、c.3476AG(p.N1159S)、c.1967AC(p.E656A)和c.1554GT(p.K518N),它們分別是從五名相互獨(dú)立的癲癇患者中被鑒定出來(lái)的,這些病人沒有陣發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙。其中c.2984AG(p.N995S)這個(gè)突變分別以新發(fā)突變(de novo mutation)的形式發(fā)生在兩個(gè)獨(dú)立的癲癇患者中,從遺傳學(xué)的角度而言,強(qiáng)力支持該突變和癲癇存在關(guān)聯(lián)。然而,突變基因的功能研究對(duì)于判斷一個(gè)突變到底是否能夠致病尤為重要,所以我們把這些突變分別引入到BK通道的表達(dá)質(zhì)粒上,然后轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),運(yùn)用膜片鉗技術(shù),通過記錄宏觀電流和單通道電流來(lái)研究這些突變型通道的電生理性質(zhì),從而揭示BK突變導(dǎo)致癲癇的分子機(jī)制。結(jié)果表明,在10μM的胞內(nèi)鈣離子濃度下,p.N995S突變可以使BK通道的激活GV曲線朝著負(fù)電壓的方向偏移59 mV,但是另外三個(gè)突變對(duì)BK通道的功能并沒有影響。而且,在BK通道的β4亞基存在的情況下,p.N995S突變依然可以使BK通道的激活GV曲線朝著負(fù)電壓的方向偏移71 mV。這說明了p.N995S這個(gè)突變應(yīng)該是通過增強(qiáng)BK通道的激活特性引發(fā)癲癇,而另外三個(gè)突變只是良性的變異,和癲癇之間應(yīng)該沒有什么關(guān)聯(lián)�？紤]到之前的p.D434G突變是通過增加通道的鈣離子敏感性來(lái)增強(qiáng)通道的激活特性,并且p.N995S突變位于通道的RCK2結(jié)構(gòu)域,所以我們接下來(lái)對(duì)p.N995S突變型通道的鈣離子敏感性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,p.N995S突變對(duì)BK通道激活的增強(qiáng)程度在不同的鈣離子濃度下是類似的,并且當(dāng)通道的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)被突變掉之后(p.2D2A/p.5D5N),p.N995S依然可以增強(qiáng)通道的激活特性。這些結(jié)果說明了p.N995S突變并不影響B(tài)K通道的鈣離子敏感性。之后,我們通過分析單通道電流,發(fā)現(xiàn)p.N995S突變可以增加BK通道的單通道開放機(jī)率和單通道開放駐留時(shí)間。從我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推測(cè)出,p.N995S可以增強(qiáng)BK通道的電壓激活和孔道開關(guān)之間的變構(gòu)耦合作用,并且可以穩(wěn)定通道的開放態(tài)構(gòu)象。另外,BK通道的選擇性抑制劑蕈青霉素對(duì)野生型和p.N995S突變型通道皆有阻斷作用,這個(gè)結(jié)果指出了BK通道的抑制劑可以被用來(lái)設(shè)計(jì)藥物,治療那些由BK通道活性異常增強(qiáng)而導(dǎo)致的癲癇�？偨Y(jié),我們?cè)贐K通道上鑒定出了可以引起癲癇的第一個(gè)新發(fā)突變p.N995S。與之前的p.D434G突變相比,攜帶p.N995S突變的患者只表現(xiàn)出癲癇,并沒有陣發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙。雖然這兩個(gè)突變都可以增強(qiáng)BK通道的激活特性,但是卻有著不同的分子機(jī)制。p.D434G突變是通過增加鈣離子敏感性來(lái)增強(qiáng)通道的激活特性,而p.N995S突變是通過增加單通道開放機(jī)率和單通道開放駐留時(shí)間來(lái)增強(qiáng)通道的激活特性,并且p.N995S突變不影響通道的鈣離子敏感性。我們的研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了BK通道和癲癇的相關(guān)性,為癲癇的遺傳診斷提供了理論依據(jù),并且指出了電生理研究對(duì)于判斷通道突變是否致病的重要性。我們建議,可以把BK通道作為藥物靶點(diǎn),從BK通道的抑制劑中來(lái)篩選設(shè)計(jì)抗癲癇藥物,另外可以把p.N995S突變當(dāng)作工具來(lái)研究BK通道的結(jié)構(gòu)和門控機(jī)制。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R742.1
【部分圖文】：

圖 1-1 離子通道的卡通示意圖 （圖片來(lái)源：http://umdberg.pbworks.com/Diffusion-through-an-ion-channel）Figure 1-1 Cartoon of ion channel子通道的研究歷史 18 世紀(jì) 80 年代，生物電磁學(xué)的先驅(qū)，意大利生物學(xué)家 L. Galvani電刺激已經(jīng)死亡的蛙腿，能夠使得蛙腿產(chǎn)生抽搐，這一現(xiàn)象被認(rèn)

中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 離子通道也被他們克隆了出來(lái)。自此之后，越來(lái)越多的來(lái)，后面隨著免疫技術(shù)、蛋白純化技術(shù)和基因技術(shù)等分再后來(lái)的晶體 X 射線衍射、核磁共振、冷凍電鏡等成離子通道的研究更是從間接的功能研究逐漸過渡到了直克菲勒大學(xué)的 R. MacKinnon 等人利用晶體 X 射線衍射霉菌里面的一種鉀離子通道 KcsA 的三維結(jié)構(gòu)[28]，如圖

16圖 1-3 電壓門控型離子通道超級(jí)家族 （圖片來(lái)源：tp://www.guidetoimmunopharmacology.org/GRAC/ReceptorFamiliesForward?type=IFigure 1-3 The voltage-gated ion channel superfamily配體門控型離子通道又稱為離子通道型受體或者化學(xué)門控型離子通道，是通過與特定化學(xué)物質(zhì)結(jié)合來(lái)改變門開放狀態(tài)的離子通道。這類離子通道都典型的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是跨膜結(jié)構(gòu)域，用來(lái)形成離子孔道，另一個(gè)是配體結(jié)變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)），用來(lái)相應(yīng)特定的化學(xué)配體，從而控制離子通道的開放與門控型離子通道依據(jù)其響應(yīng)配體的不同，可以細(xì)分為三類：半胱氨酸環(huán)受

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 侯盼盼;BK通道的動(dòng)態(tài)鈣離子敏感性以及α/β亞基間相互作用機(jī)制的研究[D];華中科技大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2821825