背景神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma,NB)屬于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤,可起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)的任意神經(jīng)脊部位,其最常見的原發(fā)部位是交感神經(jīng)鏈和腎上腺髓質(zhì),但也可發(fā)生于頸部、胸部、腹部以及盆腔的神經(jīng)組織等部位。將近一半的NB發(fā)生于2歲以內(nèi)的嬰幼兒,少數(shù)患者可轉(zhuǎn)化成良性腫瘤甚至自然消退,但大部分治療仍存在較大難度,且預(yù)后不良。目前NB的治療方式仍以手術(shù)、化療和放療為主,但由于放療、化療等治療手段會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用,因此迫切需要尋找新的安全有效的藥物。研究報(bào)道五味子具有重要的抗癌功能,五味子醇甲作為五味子木脂素的主要成分,其抗癌效果也被多次報(bào)道,但具體機(jī)制尚不明確。由于五味子醇甲屬于小分子脂溶性物質(zhì),可能會(huì)通過血腦屏障,因而該藥可為神經(jīng)疾病的治療提供支持。本次實(shí)驗(yàn)首次選用五味子醇甲處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞,探索該藥是否能夠抑制SH-SY5Y細(xì)胞的增殖和遷移,并探討其可能的機(jī)制,所得結(jié)果可能為NB的臨床治療提供新的研究靶點(diǎn)。目的通過探索五味子醇甲抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞增殖及遷移的可能機(jī)制,為用五味子醇甲作為臨床藥物治療NB提供新的理論支持。方法1.神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中分別加入不同濃度的五味子醇甲,經(jīng)不同時(shí)間處理后用MTT檢測細(xì)胞活性,確定五味子醇甲適宜作用時(shí)間和濃度。2.SH-SY5Y細(xì)胞加入不同濃度的五味子醇甲處理后通過DAPI染色和流式技術(shù)檢測細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選用qRT-RCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測Bcl-2、Bcl-xl、Bax和p-AMPK等基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。3.SH-SY5Y細(xì)胞加入不同濃度的五味子醇甲處理后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行活細(xì)胞周期檢測。并根據(jù)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象,通過qRT-RCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測cyclinD1、CDK4和P21等基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。4.SH-SY5Y細(xì)胞加入不同濃度的五味子醇甲處理后通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移程度;并將相同濃度的五味子醇甲加至200個(gè)/mL濃度的細(xì)胞中,連續(xù)培養(yǎng)多天后觀察細(xì)胞集落克隆結(jié)果。根據(jù)此實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象,分別用qRT-RCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測MMP9、HIF-1α和VEGF等基因的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果1.SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)不同濃度的五味子醇甲分別處理,經(jīng)不同時(shí)間處理后,MTT結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比,五味子醇甲處理組細(xì)胞隨著藥物濃度增加和處理時(shí)間的延長,增殖抑制率明顯增加,與藥物作用時(shí)間和劑量成正相關(guān)。2.DAPI染色和流式凋亡檢測結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,五味子醇甲處理組細(xì)胞凋亡數(shù)目增多,且核凋亡現(xiàn)象明顯。qRT-RCR結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比Bcl-2和Bcl-xl的mRNA表達(dá)水平呈下降趨勢;Western Blot結(jié)果顯示Bcl-2的蛋白表達(dá)水平降低,而Bax和p-AMPK的蛋白表達(dá)水平增加。3.流式技術(shù)檢測各處理組細(xì)胞周期分布情況,結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,隨藥物濃度增加,G2/M期細(xì)胞比例增加,G1期比例減少,即發(fā)生了G2/M期周期阻滯。qRT-RCR和Western Blot結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比cyclinD1、CDK4的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低,與五味子醇甲劑量呈負(fù)相關(guān),但P21的蛋白表達(dá)水平升高,與藥物劑量呈正相關(guān)。4.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,五味子醇甲處理組細(xì)胞遷移能力明顯減弱;集落克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:藥物處理組細(xì)胞克隆數(shù)目及大小與對(duì)照組相比明顯減少,與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)。qRT-RCR和Western Blot結(jié)果顯示:MMP9、HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低,與五味子醇甲劑量呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論1.五味子醇甲對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的增殖及遷移具有抑制作用,且呈時(shí)間和劑量依賴性。2.五味子醇甲可能通過影響cyclinD1、CDK4和P21等基因的表達(dá)阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程,也可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族基因的表達(dá)促進(jìn)了SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡,發(fā)揮抗增殖作用。3.五味子醇甲抑制SH-SY5Y細(xì)胞的遷移可能是通過抑制MMP9、HIF-1α和VEGF等基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。
【學(xué)位單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.4
【部分圖文】：

圖3-8：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)后，連續(xù)觀察3天，分別在24 h、48 h和72 h進(jìn)行拍照。圖A為鏡下拍攝圖為統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。*p<0.05，**p<0.01。移相關(guān)的基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平步明確五味子醇甲抑制SH-SY5Y細(xì)胞遷移可能機(jī)制，細(xì)胞分別、5 μM、10 μM、20 μM）的五味子醇甲培養(yǎng)72 h后，qRT-PCR和細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）VEGF）等基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照用組細(xì)胞中MMP9、HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平依賴性。p<0.05，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 竇志華;安莉萍;陳敏;繆應(yīng)祥;喬進(jìn);陳霞;馮艷;;一測多評(píng)法同時(shí)測定五味子中6種木脂素類成分含量[J];中國藥學(xué)雜志;2014年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 談衛(wèi)強(qiáng);青蒿素抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2821123