目的:現(xiàn)如今,神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中較為普遍的原發(fā)性顱腦惡性腫瘤。該疾病具有發(fā)病率高、致死率高、預(yù)后差等疾病特點(diǎn),目前國(guó)內(nèi)外臨床治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤所采用的治療方案基本以手術(shù)治療為主并輔助放化療的綜合治療方案。盡管患者接受目前臨床治療方案,但神經(jīng)膠質(zhì)瘤術(shù)后生存率及復(fù)發(fā)率仍處于一個(gè)不容樂(lè)觀的局面。本課題以小分子RNA(microRNA,miRNA)miR-148a為研究對(duì)象,在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中篩選潛在靶基因腫瘤抑制子18(Suppression of Tumorigenicity 18 ST18),并對(duì)所篩選靶基因進(jìn)行驗(yàn)證,同時(shí)研究其在miR-148a調(diào)控下,對(duì)多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastomamultiforme,GBM)生物學(xué)功能的影響。為將來(lái)臨床靶向治療GBM提供新的方向和思路奠定理論基礎(chǔ)。方法:1.利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(TargetScan、miRanda、miRBase)篩選miR-148a-3p的潛在靶基因:使用目前生物信息學(xué)研究中常用的靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)包括,從其中查找出miR-148a潛在靶基因,利用文獻(xiàn)閱讀排除目前生物信息學(xué)在GBM領(lǐng)域研究的miR-148a的靶基因,選擇可能性較大的靶基因ST18作為本課題研究的靶基因。2.運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blotting手段檢測(cè)ST18基因在各GBM細(xì)胞系中的表達(dá)程度:通過(guò)qRT-PCR及Western Blotting手段測(cè)定ST18基因在永生化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(HA1800)和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87、U251)中的mRNA和蛋白表達(dá)水平;并檢測(cè)ST18基因在miR-148a不同表達(dá)條件下(過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá))的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的mRNA和蛋白表達(dá)水平。3.利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-148a與ST18基因的靶向關(guān)系:在HEK-293T細(xì)胞中,利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-148a-3p與ST18靶基因的靶向關(guān)系。4.利用Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)以及劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)miR-148a-3p調(diào)控ST18基因?qū)ι窠?jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的生物學(xué)功能影響:在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞U87和U251細(xì)胞系中,利用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-148a-3p調(diào)控ST18基因?qū)ι窠?jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響;利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-148a-3p調(diào)控ST18基因?qū)ι窠?jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果:1.成功篩選出研究靶基因,ST18為miR-148a-3p的潛在靶基因之一:各生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)顯示,ST18是miR-148a-3p的下游靶向調(diào)控靶基因。2.ST18基因在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá):qRT-PCR結(jié)果顯示,在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87、U251、T98G)中ST18基因的mRNA表達(dá)水平較永生化膠質(zhì)細(xì)胞(HA1800)明顯降低。3.miR-148a-3p靶向調(diào)控ST18基因:過(guò)表達(dá)或抑制miR-148a-3p表達(dá)后,利用qRT-PCR和Western blotting分別檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87、U251)中ST18基因的mRNA和蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),在過(guò)表達(dá)miR-148a-3p的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,ST18基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低;抑制miR-148a-3p表達(dá)時(shí),各膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中ST18基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高。此外,在轉(zhuǎn)染報(bào)告基因質(zhì)粒的HEK-293T細(xì)胞中,熒光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果顯示:ST18-WT+miR-148a實(shí)驗(yàn)組與ST18-WT+miR-148a-NC對(duì)照組相比較,ST18-WT+miR-148a實(shí)驗(yàn)組組熒光強(qiáng)度明顯下降,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。表明,在腦經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-148a-3p直接作用于ST18。4.miR-148a-3p通過(guò)調(diào)控ST18進(jìn)一步增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的遷移能力:在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251中,將ST18基因過(guò)表達(dá)后進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)ST18基因過(guò)表達(dá)后能顯著降低腦膠質(zhì)瘤的遷移能力;另一方面,通過(guò)Transwell驗(yàn)證細(xì)胞的遷移能力時(shí)我們觀察到,ST18過(guò)表達(dá)能夠降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力;且過(guò)表達(dá)ST18基因同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-148a-3p能夠顯著恢復(fù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力。表明,miR-148a-3p能夠通過(guò)靶向調(diào)控ST18基因促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移。5.miR-148a-3p靶向調(diào)控ST18基因促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲能力:在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251中,利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力,結(jié)果顯示,ST18過(guò)表達(dá)能夠降低腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力;且過(guò)表達(dá)ST18基因同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-148a-3p能夠顯著恢復(fù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。表明,miR-148a-3p能夠通過(guò)靶向調(diào)控ST18基因促進(jìn)神經(jīng)腦瘤細(xì)胞侵襲能力。結(jié)論:1.ST18是miR-148a-3p的靶基因之一。2.miR-148a-3p靶向調(diào)控ST18基因促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移與侵襲。
【學(xué)位單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.41

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本文編號(hào)：2817750