目的:現(xiàn)如今,神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中較為普遍的原發(fā)性顱腦惡性腫瘤。該疾病具有發(fā)病率高、致死率高、預(yù)后差等疾病特點,目前國內(nèi)外臨床治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤所采用的治療方案基本以手術(shù)治療為主并輔助放化療的綜合治療方案。盡管患者接受目前臨床治療方案,但神經(jīng)膠質(zhì)瘤術(shù)后生存率及復(fù)發(fā)率仍處于一個不容樂觀的局面。本課題以小分子RNA(microRNA,miRNA)miR-148a為研究對象,在腦膠質(zhì)瘤細胞系中篩選潛在靶基因腫瘤抑制子18(Suppression of Tumorigenicity 18 ST18),并對所篩選靶基因進行驗證,同時研究其在miR-148a調(diào)控下,對多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤(Glioblastomamultiforme,GBM)生物學(xué)功能的影響。為將來臨床靶向治療GBM提供新的方向和思路奠定理論基礎(chǔ)。方法:1.利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(TargetScan、miRanda、miRBase)篩選miR-148a-3p的潛在靶基因:使用目前生物信息學(xué)研究中常用的靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫包括,從其中查找出miR-148a潛在靶基因,利用文獻閱讀排除目前生物信息學(xué)在GBM領(lǐng)域研究的miR-148a的靶基因,選擇可能性較大的靶基因ST18作為本課題研究的靶基因。2.運用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blotting手段檢測ST18基因在各GBM細胞系中的表達程度:通過qRT-PCR及Western Blotting手段測定ST18基因在永生化神經(jīng)膠質(zhì)細胞(HA1800)和腦膠質(zhì)瘤細胞系(U87、U251)中的mRNA和蛋白表達水平;并檢測ST18基因在miR-148a不同表達條件下(過表達或抑制表達)的腦膠質(zhì)瘤細胞系中的mRNA和蛋白表達水平。3.利用熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-148a與ST18基因的靶向關(guān)系:在HEK-293T細胞中,利用熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-148a-3p與ST18靶基因的靶向關(guān)系。4.利用Transwell遷移和侵襲實驗以及劃痕實驗來檢測miR-148a-3p調(diào)控ST18基因?qū)ι窠?jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲的生物學(xué)功能影響:在神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤細胞U87和U251細胞系中,利用劃痕實驗和Transwell遷移實驗檢測miR-148a-3p調(diào)控ST18基因?qū)ι窠?jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移能力的影響;利用Transwell侵襲實驗檢測miR-148a-3p調(diào)控ST18基因?qū)ι窠?jīng)膠質(zhì)瘤細胞侵襲能力的影響。結(jié)果:1.成功篩選出研究靶基因,ST18為miR-148a-3p的潛在靶基因之一:各生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示,ST18是miR-148a-3p的下游靶向調(diào)控靶基因。2.ST18基因在腦膠質(zhì)瘤細胞中呈現(xiàn)低表達:qRT-PCR結(jié)果顯示,在腦膠質(zhì)瘤細胞系(U87、U251、T98G)中ST18基因的mRNA表達水平較永生化膠質(zhì)細胞(HA1800)明顯降低。3.miR-148a-3p靶向調(diào)控ST18基因:過表達或抑制miR-148a-3p表達后,利用qRT-PCR和Western blotting分別檢測腦膠質(zhì)瘤細胞系(U87、U251)中ST18基因的mRNA和蛋白表達情況發(fā)現(xiàn),在過表達miR-148a-3p的腦膠質(zhì)瘤細胞中,ST18基因的mRNA和蛋白表達水平較對照組明顯降低;抑制miR-148a-3p表達時,各膠質(zhì)瘤細胞系中ST18基因的mRNA和蛋白表達水平較對照組明顯增高。此外,在轉(zhuǎn)染報告基因質(zhì)粒的HEK-293T細胞中,熒光強度檢測結(jié)果顯示:ST18-WT+miR-148a實驗組與ST18-WT+miR-148a-NC對照組相比較,ST18-WT+miR-148a實驗組組熒光強度明顯下降,且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。表明,在腦經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中miR-148a-3p直接作用于ST18。4.miR-148a-3p通過調(diào)控ST18進一步增強神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤的遷移能力:在腦膠質(zhì)瘤細胞U87和U251中,將ST18基因過表達后進行劃痕實驗,發(fā)現(xiàn)ST18基因過表達后能顯著降低腦膠質(zhì)瘤的遷移能力;另一方面,通過Transwell驗證細胞的遷移能力時我們觀察到,ST18過表達能夠降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移能力;且過表達ST18基因同時過表達miR-148a-3p能夠顯著恢復(fù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力。表明,miR-148a-3p能夠通過靶向調(diào)控ST18基因促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移。5.miR-148a-3p靶向調(diào)控ST18基因促進神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤細胞侵襲能力:在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87和U251中,利用Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力,結(jié)果顯示,ST18過表達能夠降低腦膠質(zhì)瘤細胞侵襲能力;且過表達ST18基因同時過表達miR-148a-3p能夠顯著恢復(fù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力。表明,miR-148a-3p能夠通過靶向調(diào)控ST18基因促進神經(jīng)腦瘤細胞侵襲能力。結(jié)論:1.ST18是miR-148a-3p的靶基因之一。2.miR-148a-3p靶向調(diào)控ST18基因促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的遷移與侵襲。
【學(xué)位單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.41

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本文編號：2817750