背景多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis,MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)自體免疫性疾病,即機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)對環(huán)繞在神經(jīng)軸突上的髓鞘發(fā)動進(jìn)攻,導(dǎo)致髓鞘脫落并形成病灶。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)的病理特征與MS非常相似,因此成為研究和治療MS的重要動物模型。經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(Menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenSC)由于其獲取的無侵略性、短周期和可重復(fù)性,其優(yōu)勢對比其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞,如骨髓、臍帶、脂肪、胎盤和胚胎干細(xì)胞等更為明顯,且未檢索到利用MenSC來治療EAE的文獻(xiàn)報道。另一方面,雖然有一些用其他類型干細(xì)胞治療EAE的文獻(xiàn)報道,但其作用機(jī)制仍不十分清楚,因此本課題旨在探究MenSC對EAE的治療效果及可能的分子及細(xì)胞機(jī)制。目的1.建立MenSC的分離培養(yǎng)體系。2.建立小鼠EAE模型。3.探究MenSC移植治療小鼠EAE的效果。4.探究MenSC治療小鼠EAE的作用機(jī)制。方法1.從新鮮的經(jīng)血樣本中提取、培養(yǎng)和鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞,為后續(xù)實驗提供高質(zhì)量和足夠數(shù)量的經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細(xì)胞。2.構(gòu)建小鼠EAE模型,通過皮下注射含MOG_(35-55)和有熱滅活的結(jié)核分枝桿菌的完全弗氏佐劑(CFA)的乳化液,并于當(dāng)天和第二天分別尾靜脈注射相同劑量的百日咳毒素(PTX)來構(gòu)建小鼠EAE模型。3.細(xì)胞移植采用尾靜脈注射和腹腔注射;動物解剖,從脾臟、淋巴結(jié)等各個器官中提取免疫細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞表面和胞內(nèi)染色,用流式細(xì)胞術(shù)對其進(jìn)行分類和鑒定。結(jié)果1.用本實驗建立的培養(yǎng)體系,從經(jīng)血樣本中成功提取出間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定后表明其符合國際間充質(zhì)干細(xì)胞的認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)。2.分別在EAE誘導(dǎo)前一天(day-1)、第6天(day6)、第10天(day10)和第19天(day19)注射同等劑量(1×10~6個/只)的MenSC,結(jié)果表明:在day-1、day6和day10這三個時間點注射干細(xì)胞均能不用程度地抑制EAE疾病的進(jìn)展,day6尤為明顯,但在day19注射干細(xì)胞并不能改善EAE的臨床評分。3.尾靜脈注射和腹腔注射同等劑量的MenSC,從EAE臨床評分結(jié)果來看,兩種注射方式均能顯著改善EAE的臨床癥狀,但相比腹腔注射,尾靜脈注射的抑制效果更好。4.對比未注射MenSC的EAE小鼠,經(jīng)MenSC治療過的小鼠,其外周免疫器官和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的CD4~+T細(xì)胞、Th1和Th17細(xì)胞所占比例明顯降低,且外周神經(jīng)系統(tǒng)中的MOG特異性T細(xì)胞Th1和Th17的比例也明顯降低。結(jié)論1.對小鼠EAE模型進(jìn)行細(xì)胞移植治療時,細(xì)胞移植時間點的選擇對EAE的臨床評分有直接的影響,day-1、day6和day10注射MenSC均能改善EAE的臨床癥狀,且day6注射的治療效果最好,但在day19注射MenSC不能降低EAE的臨床評分。2.MenSC進(jìn)入EAE小鼠體內(nèi)可能是通過抑制外周免疫器官和CNS中CD4~+T細(xì)胞、MOG特異性T細(xì)胞、Th1和Th17細(xì)胞來發(fā)揮作用的。
【學(xué)位單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R742.9
【部分圖文】：

19圖 2 MenSC 的流式鑒定圖注：將收獲的 P3 的 MenSC 進(jìn)行細(xì)胞表面染色，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測到其表面應(yīng)該表達(dá)和不應(yīng)該表達(dá)的標(biāo)記物。Fig. 2 Identify of MenSC by Flow cytometryNote: MenSC were stained from passage 3 to test the markers should or should’t be express by flowcytometry.

圖 8 對 EAE 小鼠脾臟中 CD4+T 細(xì)胞的持續(xù)追蹤注：A：流式染色效果。B：通過流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計不同時間點 CD4+T 細(xì)胞的占比情況。Fig. 8 Tracing of CD4+T cells in spleen of EAE miceote: A: Showed the quality of the staining after testing the single cells from spleen of EAE mice.tatistics of CD4+T cells in spleen on different time points by flow cytometry..2.2 CD4+T 細(xì)胞在中樞神經(jīng)中的百分比與小鼠疾病的相關(guān)性為了探究 EAE 小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的 CD4+T 細(xì)胞的浸潤情況，以 na ve 小鼠照，在 day19 取 EAE 小鼠的脊髓和腦，在提取到 EAE 小鼠腦和脊髓的單個核細(xì)，計數(shù)定容到 8×106個/mL，后取 500μL 與 500μL 的 MOG 刺激液混合后，于恒養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）刺激 6 個小時后，收獲細(xì)胞，染色后，通過流式細(xì)胞術(shù)其中樞神經(jīng)系統(tǒng)中 CD4+T 細(xì)胞的浸潤情況，結(jié)果顯示，對比 na ve 小鼠，EAE 中樞神經(jīng)系統(tǒng)中 CD4+T 細(xì)胞的占比大大增加，這說明 EAE 小鼠之所以發(fā)病的原一與大量的 CD4+T 細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的浸潤有關(guān)。

圖 9 在 EAE 誘導(dǎo)后第 19 天，對比檢測 EAE 和健康小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中 CD4+T 細(xì)胞的浸潤情況圖注：A：流式染色效果。B：健康小鼠和 EAE 小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中 CD4+T 細(xì)胞的占比差異。Fig. 9 Infiltration of CD4+T cells in CNS of EAE and na ve mice on day19Note: A: Showed that the quality of the staining after testing the single cells from brain and spinal cordof EAE mice. B: Difference of CD4+T cells in CNS of EAE and na ve mice by flow cytometry.2.2.3 MenSC 對外周免疫器官和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的 CD4+T 細(xì)胞的抑制作用被誘導(dǎo)后的小鼠在 day6 時，以尾靜脈的方式給小鼠注射 106個 MenSC，在 day15時，取小鼠脾臟，引流淋巴結(jié)，腦和脊髓中的單個核細(xì)胞，計數(shù)定容到 8×106個/mL，后取 500μL 與 500μL 的 MOG 刺激液混合后，于恒溫培養(yǎng)箱中（37℃，5% CO2）刺激 6 個小時后，收獲細(xì)胞，染色經(jīng)流式檢測后，實驗數(shù)據(jù)表明，經(jīng)過 MenSC 治療過的小鼠， 無論是在脾臟、引流淋巴結(jié)還是腦和脊髓中，CD4+T 細(xì)胞的數(shù)量均比未處理組低，且在脾臟中 CD4+T 細(xì)胞的減少尤為顯著。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2816773