目的：探討血管活性腸肽(vocative intestinal peptide,VIP)對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)大鼠的防治作用及其免疫學機制,為VIP治療多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)尋找理論依據(jù)。方法：通過隨機雙盲法,將60只雌性Wistar大鼠(200g-250g/只)分成4組,每組各15只：正常對照組、EAE對照組、VIP低劑量防治組和VIP高劑量防治組。將粗制髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)+完全福氏佐劑complete freud's adjuvant,CFA)注入EAE對照組及VIP低、高劑量防治組大鼠雙側后肢足掌皮下(0.2ml/100g)進行主動免疫,正常對照組給予等量生理鹽水+CFA,免疫后0小時及48小時分別給各組大鼠腹腔注射百日咳素(pertussis toxin,PTX)(0.2ml/只)建立EAE模型。自造模當日起,VIP低、高劑量防治組每隔一日分別腹腔注射VIP 4nmol/kg (0.2ml)、16nmol/kg (0.8ml),正常對照組及EAE對照組每隔一日腹腔注射0.8ml生理鹽水,連續(xù)10天。將連續(xù)3天癥狀評分無加重、四肢癱瘓或死亡作為各組大鼠發(fā)病高峰期,在發(fā)病高峰期處死大鼠,未發(fā)病大鼠觀察8周后處死。保留大鼠下腔靜脈血、腦脊髓組織及脾臟。1.記錄發(fā)病大鼠潛伏期、進展期和高峰期神經(jīng)功能障礙評分變化。2.觀察各組發(fā)病大鼠腦脊髓組織基本病理改變。3.通過免疫組織化學法,采用抗膠質纖維酸性蛋白抗體(GFAP)檢測各組大鼠腦組織內的星型膠質細胞活化情況；用髓鞘堿性蛋白(MBP)抗體染色標記各組大鼠腦白質內的髓鞘,觀察其脫失情況。4.流式細胞儀檢測各組大鼠脾臟中CD4+CD25+Treg/CD4+T細胞比例變化。5.放射免疫法檢測各組大鼠腦組織勻漿中IL-17A、TGF-β1因子含量變化。6.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測血清中IFN-γ、IL-4因子含量變化。7.將EAE對照組及VIP各劑量防治組指標進行相關性分析。結果： (1)大鼠發(fā)病情況：正常對照組大鼠未發(fā)病,EAE對照組及VIP各劑量防治組大鼠均出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀。發(fā)病大鼠先后表現(xiàn)為食量下降、精神萎靡、后肢無力、尾部拖地,在免疫后第14-17天癥狀最為典型：大鼠出現(xiàn)雙側后肢無力拖地、行走畫圈、爬行困難、自傷后肢、精神極度衰弱、抽搐、甚至死亡。①潛伏期：與EAE對照組比較,VIP各劑量防治組大鼠發(fā)病潛伏期均延長,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),VIP高劑量防治組潛伏期較VIP低劑量防治組延長(P0.01)；②進展期：與EAE對照組比較,VIP各劑量防治組進展期均縮短(P0.05、P0.01)；VIP高劑量防治組進展期較VIP低劑量防治組明顯縮短(P0.05)；③高峰期神經(jīng)功能障礙評分：與EAE對照組相比,VIP低劑量防治組神經(jīng)功能障礙評分降低,但差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05),VIP高劑量防治組神經(jīng)功能障礙評分較EAE對照組及VIP低劑量防治組均明顯降低(P0.01)。(2)腦脊髓組織病理改變：正常對照組大鼠腦脊髓未見炎細胞浸潤；與EAE對照組比較,VIP各劑量防治組炎細胞浸潤評分均顯著(P0.01)；與VIP低劑量防治組比較,VIP高劑量防治組炎細胞浸潤評分明顯降低(P0.01)。 (3)腦組織免疫組化結果①星型膠質細胞活化情況：正常對照組腦組織中未見GFAP陽性細胞；EAE對照組大鼠腦組織側腦室旁可見活化的星形膠質細胞呈彌漫性分布；VIP各劑量防治組中GFAP陽性細胞數(shù)有所減少,以血管周圍反應明顯。與EAE對照組比較,VIP各劑量防治組腦組織側腦室旁GFAP陽性細胞的平均光密度值(IOD)明顯減小(P0.01、P0.05)；與VIP低劑量防治組比較,VIP高劑量防治組GFAP陽性細胞的平均光密度值(IOD)明顯減小(P0.01)；②髓鞘脫失變化：正常對照組髓鞘保持完整；在EAE對照組、VIP各劑量防治組腦組織側腦室旁出現(xiàn)了不同程度脫髓鞘脫失。與EAE對照組比較,VIP各劑量防治組腦組織側腦室旁MBP染色陽性表達的平均光密度值(IOD)明顯增加(P0.01、P0.05)；與VIP低劑量防治組比較,VIP高劑量防治組腦組織側腦室旁MBP陽性表達的平均光密度值(IOD)明顯增加(P0.01)。(4)脾組織CD4+CD25+Treg/CD4+T細胞比例變化：與正常對照組比較,EAE對照組脾組織中CD4+CD25+Treg/CD4+T細胞比例明顯降低(P0.01)；與EAE對照組比較,VIP各劑量防治組大鼠脾組織中CD4+CD25+Treg/CD4+T細胞比例明顯升高(P0.01、P0.05)；與VIP低劑量防治組比較,VIP高劑量防治組大鼠脾組織CD4+CD25+Treg/ CD4+T細胞比例顯著上升(P0.01)。 (5)腦組織勻漿中IL-17A、TGF-β1含量變化：與正常對照組比較,EAE對照組、VIP各劑量防治組大鼠腦組織勻漿IL-17A水平明顯升高(P均0.01)；與EAE對照組比較,VIP各劑量防治組大鼠腦組織勻漿中IL-17A水平均顯著降低(P0.01)；與VIP低劑量防治組比較,VIP高劑量防治組腦組織勻漿中的IL-17A水平明顯降低(P0.01)。與正常對照組相比,EAE對照組、VIP各劑量防治組大鼠腦組織勻漿TGF-β1水平明顯降低(P0.01、P0.05),與EAE對照組相比,VIP各劑量防治組大鼠腦組織勻漿TGF-α1水平均顯著升高(P0.01)；與VIP低劑量防治組比較,VIP高劑量防治組大鼠腦組織勻漿中TGF-α1水平明顯上升(P0.01)；(6)血清中IFN-γ、IL-4含量變化：與正常對照組比較,EAE對照組、VIP各劑量防治組大鼠血清中IFN-γ含量明顯升高(P0.01、P0.05)；與EAE對照組比較,VIP各劑量防治組血清中IFN-γ含量顯著降低(P0.01、P0.05);與VIP低劑量防治組比較,VIP高劑量防治組血清中IFN-y含量明顯降低(P0.05)。與正常對照組比較,EAE對照組、VIP各劑量防治組大鼠血清中IL-4水平均明顯降低(P0.01)；與EAE對照組比較,VIP各劑量防治組血清中IL-4水平均顯著提高(P0.01)；與VIP低劑量防治組比較,VIP高劑量防治組血清中IL-4水平明顯提高(P0.01)。(7)相關性分析：①EAE對照組、VIP各劑量防治組大鼠發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分與腦組織勻漿中IL-17A含量及血清IFN-y水平均呈正相關(P0.01),與脾組織電CD4+CD25+Treg/CD4+T細胞比例、腦組織勻漿中TGF-β1含量及血清中IL-4水平均呈負相關(P0.01)。②EAE對照組、VIP各劑量防治組大鼠發(fā)病高峰期炎性細胞浸潤程度評分與腦組織勻漿中IL-17A含量及血清IFN-γ水平呈正相關(P0.01),與脾組織CD4+CD25+Treg/CD4+T細胞比例、腦組織勻漿中TGF-β1含量及血清中IL-4水平呈負相關(P0.01)。③EAE對照組、VIP各劑量防治組大鼠高峰期腦組織GFAP陽性細胞的平均光密度值(IOD)與腦組織勻漿中IL-17A含量及血清IFN-γ水平呈正相關(P0.01),與脾組織CD4+CD25+Treg/CD4+T細胞比例、腦組織勻漿中TGF-β1含量及血清中IL-4水平呈明顯負相關(P0.01)。④EAE對照組、VIP各劑量防治組大鼠發(fā)病高峰期腦組織MBP陽性表達的平均光密度值(IOD)與腦組織勻漿中IL-17A含量及血清IFN-y水平與呈明顯負相關(P均0.01),與脾組織CD4+CD25+Treg/CD4+T細胞比例、腦組織勻漿中TGF-β1含量及血清中IL-4水平呈正相關(P0.01)。結論：1.EAE大鼠存在Th1/Th2細胞因子、Th17/CD4+CD25+Treg細胞因子比例失衡。發(fā)病高峰期體內Th1型細胞因子IFN-γ及Th17型細胞因子IL-17升高,Th2型細胞因子IL-4及Treg細胞因子TGF-β1降低,免疫格局向Thl型偏移,同時破壞了CD4+CD25+Treg細胞介導的外周及中樞免疫耐受,該免疫平衡的破壞影響著EAE大鼠發(fā)病的潛伏期、進展期和高峰期神經(jīng)功能障礙評分。2.VIP通過延長EAE大鼠發(fā)病潛伏期、縮短進展期、降低神經(jīng)功能障礙評分等緩解EAE的臨床癥狀,同時通過減輕腦脊髓組織炎細胞浸潤、抑制星型膠質細胞活化及髓鞘脫可失改善EAE的病理損害,從而對發(fā)揮EAE發(fā)病的防治作用。3.VIP通過激活Th2細胞、上調CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量及分泌功能,抑制Thl細胞、Th17細胞活性,保持Thl/Th2細胞,Th17/CD4+CD25+Treg細胞平衡,促進抑炎因子IL-4、TGF-β1產生,抑制致炎因子IFN-γ、IL-17生成,維持中樞及外周免疫耐受,減輕臨床表現(xiàn)及病理改變,對EAE大鼠發(fā)揮保護作用。
【學位單位】：四川醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R744.51

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本文編號：2816844