帕金森病(Parkinson's disease,PD)是繼阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)后第二大最常見的神經(jīng)退行性疾病。雖然遺傳、環(huán)境和老化因素對PD發(fā)病均起到一定作用,但確切的發(fā)病機(jī)制并不清楚。PD最重要的神經(jīng)病理學(xué)特征表現(xiàn)為黑質(zhì)區(qū)殘存的多巴胺神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體,即為路易小體,其主要成分是聚集的α-突觸核蛋白。α-突觸核蛋白是一種朊病毒樣蛋白(Prion-like proteins),通過胞吞和胞吐作用在細(xì)胞與細(xì)胞間傳遞,能夠被神經(jīng)元釋放,進(jìn)而被周圍的細(xì)胞(包括神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞等)再攝取,從而能夠在細(xì)胞與細(xì)胞之間、相互聯(lián)系的結(jié)構(gòu)之間進(jìn)行傳遞。研究表明,α-突觸核蛋白能夠通過外泌體(Exosomes)被神經(jīng)元釋放。外泌體是一種30-100nm的膜性囊泡,由細(xì)胞內(nèi)的多泡體(multivesicular bodies,MVBs)和細(xì)胞膜融合后釋放,進(jìn)而被周圍的細(xì)胞再攝取。同時(shí)外泌體能夠?qū)NA、DNA、蛋白質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)成分轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外,作用于鄰近或遠(yuǎn)距離的細(xì)胞,從而實(shí)現(xiàn)生理及疾病狀態(tài)下不同細(xì)胞間的信息交流,可見于血液、尿液、唾液等生物學(xué)樣本和體外細(xì)胞的培養(yǎng)基中。在外泌體分泌的過程中,Rab蛋白發(fā)揮了重要作用。Rab蛋白是一類小分子GTP結(jié)合蛋白家族(small GTP-binding proteins),大約由200個(gè)氨基酸組成,分子量約21-25kDa。其作為細(xì)胞囊泡運(yùn)輸中的分子開關(guān),通過鳥嘌呤核苷酸交換因子(Guanine nucleotide exchange factor,GEF)激活以及與GTP酶活化蛋白(GTP hydrolysis activator protein,GAP)結(jié)合失活來調(diào)節(jié)膜運(yùn)輸中的四個(gè)主要步驟:囊泡形成,囊泡轉(zhuǎn)運(yùn),囊泡粘附和囊泡膜與靶標(biāo)的融合。這些不同的步驟通過Rab結(jié)合GTP并與上游調(diào)控子以及下游效應(yīng)子相互作用以結(jié)合到特定的膜上實(shí)現(xiàn)。在人體的所有微量元素中,鐵是最豐富的。大腦中的鐵濃度隨著年齡的增長而增加,在伏隔核,深小腦核,紅核,部分海馬以及黑質(zhì)中鐵的含量豐富。腦內(nèi)高鐵導(dǎo)致黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元功能的損傷是神經(jīng)科學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)問題,由于鐵的細(xì)胞毒作用和它能夠促進(jìn)氧自由基產(chǎn)生的能力,使其在PD中的作用不容忽視。目前大量的研究證實(shí),黑質(zhì)鐵聚積參與了PD的發(fā)病,在PD病人及動(dòng)物模型的黑質(zhì)存在鐵選擇性的沉積。α-突觸核蛋白mRNA5'非翻譯區(qū)包含鐵反應(yīng)元件(iron responsive element,IRE),其具有鐵還原酶活性,且能夠調(diào)控轉(zhuǎn)鐵蛋白介導(dǎo)的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)過程,這些證據(jù)說明α-突觸核蛋白和胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的關(guān)系密不可分。人類SNCA基因(編碼α-突觸核蛋白的基因)A53T突變時(shí)在鐵和多巴胺存在時(shí)能夠引起α-突觸核蛋白聚集。α-突觸核蛋白聚合物在儲(chǔ)鐵過程中發(fā)揮重要作用,其過表達(dá)導(dǎo)致了神經(jīng)元鐵聚集和鐵再分配。然而,細(xì)胞內(nèi)高鐵對外泌體介導(dǎo)的α-突觸核蛋白釋放的影響尚不清楚。本研究在MES 23.5多巴胺能細(xì)胞系中,通過免疫印跡、鐵試劑盒等方法探討細(xì)胞內(nèi)高鐵狀態(tài)下是否影響外泌體α-突觸核蛋白的釋放及鐵含量的影響,同時(shí)探討與外泌體分泌相關(guān)的Rab蛋白的變化。研究結(jié)果如下:1.100μmol/L和1 mmol/L枸櫞酸鐵銨(ferric ammonium citrate,FAC)處理MES 23.5細(xì)胞4 h、12 h、24 h、48 h后,100μmol/L組在4 h和12 h時(shí),Rab35蛋白表達(dá)升高54.99%和1.07倍,與對照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);1 mmol/L FAC處理組與對照組相比,Rab35蛋白表達(dá)分別升高80.12%和79.45%,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.001)。100μmol/L和1 mmol/L FAC處理MES23.5細(xì)胞24h和48h后,Rab35蛋白表達(dá)均回到基礎(chǔ)水平。Rab5、Rab7、Rab11、Rab27a在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)沒有明顯的變化。2.0.5 mmol/L抗氧化劑N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)與100μmol/L FAC共孵育MES 23.5細(xì)胞4 h和12 h后,結(jié)果顯示單獨(dú)NAC處理組Rab35的表達(dá)即明顯上調(diào),與對照組相比,4 h上調(diào)1.24倍,12 h上調(diào)1.37倍,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);FAC單獨(dú)處理4 h組、NAC與FAC共同處理4 h組與對照組相比,分別高出89.21%、1倍,共同處理組與FAC單獨(dú)處理組相比沒有差別。FAC單獨(dú)處理12 h組、NAC與FAC共同處理12 h組與對照組相比,分別高出1.41倍、1.17倍,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。共同處理組與FAC單獨(dú)處理組相比沒有差別。結(jié)果提示,抗氧化劑NAC無法阻斷高鐵誘導(dǎo)的Rab35蛋白水平上調(diào)。3.鐵死亡抑制劑Liproxstatin-1單獨(dú)處理12 h后,Rab35的表達(dá)沒有變化。用10μmol/L Liproxstatin-1預(yù)處理30 min后,與100μmol/L FAC共處理MES 23.5細(xì)胞12 h,與對照組相比,FAC單獨(dú)處理組Rab35表達(dá)上調(diào)22.10%,FAC與Liproxstatin-1共同處理組表達(dá)上調(diào)22.73%,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),FAC與Liproxstatin-1共同處理組與FAC單獨(dú)處理組相比沒有差別。鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1單獨(dú)處理12h后,Rab35表達(dá)上調(diào)36.15%,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。用10μmol/L Ferrostatin-1預(yù)處理30 min后,與100μmol/L FAC共處理MES 23.5細(xì)胞12 h,Rab35的表達(dá)沒有明顯的變化。結(jié)果提示,鐵死亡抑制劑Liproxstatin-1無法阻斷高鐵誘導(dǎo)的Rab35蛋白水平上調(diào),鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1可能阻斷高鐵誘導(dǎo)的Rab35蛋白水平上調(diào)。4.應(yīng)用超速離心法提取外泌體,免疫印跡方法檢測到Alix的表達(dá),提示外泌體提取成功。100μmol/L FAC處理MES 23.5細(xì)胞24 h和48 h后,MES 23.5細(xì)胞外泌體中鐵含量明顯增加,與對照組相比,分別高出96.01%、2.21倍,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01,P0.001);處理48 h組與24 h組相比,高出69.20%,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。以上結(jié)果提示,細(xì)胞內(nèi)高鐵促進(jìn)MES 23.5細(xì)胞外泌體中鐵含量增加。5.攜帶α-突觸核蛋白的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MES 23.5細(xì)胞24 h后,細(xì)胞內(nèi)、上清、外泌體中α-突觸核蛋白表達(dá)明顯增加。在α-突觸核蛋白過表達(dá)的細(xì)胞中,100μmol/L FAC處理MES 23.5細(xì)胞24 h后α-突觸核蛋白上調(diào)67.47%(P0.01),與未處理組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6.在α-突觸核蛋白過表達(dá)的MES 23.5細(xì)胞中,Rab35表達(dá)沒有變化,提示α-突觸核蛋白本身不影響Rab35表達(dá)。100μmol/L FAC處理24h后,Rab35沒有明顯的變化,與前述未高表達(dá)α-突觸核蛋白的細(xì)胞中FAC處理24h后Rab35蛋白表達(dá)回到基礎(chǔ)水平的結(jié)果一致。以上結(jié)果表明,鐵能夠誘導(dǎo)MES 23.5細(xì)胞Rab35蛋白表達(dá)的上調(diào),抗氧化劑NAC和鐵死亡抑制劑Liproxstatin-1不能阻斷鐵誘導(dǎo)的Rab35蛋白表達(dá)上調(diào),而鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1可能阻斷高鐵誘導(dǎo)的Rab35蛋白水平上調(diào)。提示氧化應(yīng)激可能不參與這一過程,鐵死亡可能參與這一過程。鐵能夠促進(jìn)MES 23.5細(xì)胞中α-突觸核蛋白表達(dá)上調(diào),外泌體中鐵含量的增加。α-突觸核蛋白本身對Rab35的表達(dá)沒有影響。本實(shí)驗(yàn)在MES 23.5細(xì)胞中探討了鐵對MES 23.5細(xì)胞外泌體α-突觸核蛋白釋放的影響及機(jī)制,為進(jìn)一步闡明PD發(fā)病過程中鐵代謝異常與α-突觸核蛋白相互作用的機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R742.5

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