目的腦膠質(zhì)瘤是成人最具侵襲性的惡性腦瘤,盡管傳統(tǒng)治療方式取得了一些進(jìn)展,其難治性仍是臨床困擾的問(wèn)題,大量臨床前實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí),免疫療法是一種能夠靶向殺傷腫瘤組織的特異性治療手段。以表皮生長(zhǎng)因子受體III(Epidermal growth factor receptor type III,EGFRvⅢ)為靶點(diǎn)的嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor,CAR)T細(xì)胞過(guò)繼免疫療法是治療GBM的高效手段。與EGFR完整結(jié)構(gòu)想比較,EGFRvⅢ的第二、第三、第四、第五、第六、第七個(gè)外顯子被刪除,導(dǎo)致801個(gè)堿基對(duì)的缺席,從而形成了新的甘氨酸密碼子。在被翻譯之后,胞外區(qū)6~273氨基酸被一個(gè)甘氨酸殘基替代,最終形成了EGFRvⅢ,其特點(diǎn)是在正常組織中不表達(dá),僅在腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)~([1]),而且是一種在包括腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多數(shù)腫瘤中表達(dá)率極高的腫瘤特異性抗原,與腫瘤的許多惡性表型的出現(xiàn)密不可分,因此可當(dāng)做合適的腫瘤治療靶標(biāo),目前已經(jīng)成為備受矚目的腫瘤靶向治療的分子靶點(diǎn)。EGFRvⅢ作為一個(gè)分子靶點(diǎn),為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供了新思路,本論文中構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)EGFRvⅢ的U87細(xì)胞株,為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供研究基礎(chǔ)。方法首先EGFRvⅢ cDNA(2832bp)克隆入pCDH-CMV-MCS-EF1-puro的XbaI和NotI位點(diǎn),引物中添加His6標(biāo)簽,測(cè)序鑒定;用磷酸鈣沉淀法將含目的基因的質(zhì)粒pCDH-CMV-EGFRvⅢ-EF1-puro與慢病毒包裝質(zhì)粒pCMV-dR8.9和包膜蛋白質(zhì)粒pVSV-G三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。過(guò)濾、濃縮包裝好的病毒后,利用稀釋計(jì)數(shù)法測(cè)定病毒滴度。制備好的慢病毒感染U87細(xì)胞,嘌呤霉素篩選、有限稀釋克隆培養(yǎng)建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。Western blot采用人EGFRvⅢ單抗、His6單抗檢測(cè)篩選的細(xì)胞株,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EGFRvⅢ在U87細(xì)胞表面的表達(dá)。結(jié)果重組質(zhì)粒pCDH-EGFRvⅢ經(jīng)XbaI和NotI雙酶切、1%瓊脂糖凝膠電泳,產(chǎn)物與預(yù)期目的基因EGFRvⅢ cDNA(2832bp)大小一致;Western blot鑒定6株U87-vIII均表達(dá)EGFRvⅢ蛋白(145kd)和His6(145kd);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2株U87-vIII細(xì)胞株(U87-vIII-2,U87-vIII-4)表面均表達(dá)EGFRvⅢ蛋白(分別為93.1%和96.9%)。結(jié)論穩(wěn)定表達(dá)EGFRvⅢ的U87細(xì)胞株被成功建立,為膠質(zhì)瘤靶向治療研究提供了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R739.4
【部分圖文】：

結(jié)果H-EGFRvIII 的檢測(cè)-EGFRvIII 經(jīng) XbaI 和 NotI 雙酶切，酶切產(chǎn)物用 1%瓊脂p和8kbp的兩個(gè)片段，預(yù)期目的基因EGFRvIII cDNA分子-CMV-MCS-EF1-puro 的分子量為 7384dp，可見(jiàn)兩個(gè)片段基因和載體大小一致（圖 2.1）。DNA 測(cè)序分析結(jié)果與 N 列 一 致 ， 雙 酶 切 和 測(cè) 序 分 析 結(jié) 果 表 明 V-EGFRvIII-EF1-puro 重組成功。

圖 2.2 免疫熒光檢測(cè) pCDH-CMV-EGFRvIII-EF1-puro 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞的表達(dá)1 2 34 5圖 2.3 病毒滴定測(cè)定 顯微鏡觀察部分不同稀釋濃度的細(xì)胞

224 5圖 2.3 病毒滴定測(cè)定 顯微鏡觀察部分不同稀釋濃度的細(xì)胞病毒稀釋濃度 1～5 依次為 10-1，10-2，10-3，10-5，10-73 Western blot 檢測(cè) EGFRvIII 表達(dá)鑒定結(jié)果LV-EGFRvIII 感染 U87 細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選，抗性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得 6株細(xì)胞：U87-vIII 1～6，提取感染之后的細(xì)胞的蛋白，用 Western blot 檢測(cè)目的

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 孟凡榮;陳琛;萬(wàn)海粟;周清華;;慢病毒載體及其研究進(jìn)展[J];中國(guó)肺癌雜志;2014年12期

2 張曼;孫秀萍;宋銘晶;;慢病毒載體用于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究進(jìn)展[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2014年10期

本文編號(hào)：2813491