發(fā)布時間：2017-04-01 18:00

  本文關(guān)鍵詞：新型運輸輔助劑GF對肽-PMO在杜興肌肉萎縮癥小鼠上的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:杜興肌肉萎縮癥(Duchenne muscular dystrophy-DMD)是一種X染色體連鎖遺傳的致死性神經(jīng)肌肉失調(diào)癥。DMD的致病原因為抗肌萎縮蛋白(dystrophin)的基因發(fā)生突變,使得功能性dystrophin蛋白缺失。目前,在臨床上未見任何有效的治療。反義寡核苷酸(Antisense Oligonucleotides-AO)介導(dǎo)的外顯子跳讀療法是研究最為廣泛的一種治療方法,已經(jīng)在III期臨床試驗。但最近的報道顯示臨床測試的藥物系統(tǒng)運輸效率低,臨床試驗結(jié)果未達到預(yù)期。因此,研發(fā)安全高效的藥物運輸輔助劑,以提高AO藥物在全身肌肉中的運輸效率,對于DMD的外顯子跳讀治療乃至其他疾病的治療顯得尤為重要。針對這一關(guān)鍵科學問題,我們研發(fā)了一種新型藥物運輸輔助劑GF(2.5%glucose:2.5%fructose),在前期研究工作中發(fā)現(xiàn):GF能顯著促進mdx小鼠全身骨骼肌內(nèi)反義寡核苷酸藥物PMO的攝取及活性,但在心肌中未檢測到dystrophin蛋白的表達。而心肌衰竭是限制DMD患者壽命的重要因素,是DMD治療中需攻克的難題之一。為檢測GF對mdx小鼠心肌和平滑肌的作用效果,本研究利用課題組前期研發(fā)的一系列能夠在mdx小鼠體內(nèi)發(fā)揮高效作用的肽修飾的PMO(Peptide-PMO,PPMO)類藥物,在mdx小鼠上系統(tǒng)測試GF與不同肽-PMO在不同劑量下,對mdx小鼠心肌及平滑肌的作用。本研究分別測試了三類肽-PMO藥物,包括R-PMO、Pip5e-PMO和B-MSP-PMO,這些AO藥物能夠高效誘導(dǎo)mdx心肌中dystrophin蛋白表達。通過將這三類藥物分別與GF在mdx小鼠體內(nèi)展開系統(tǒng)研究,旨在測試GF能否增強AO藥物在mdx心肌和平滑肌中的運輸效率。方法:1.藥物注射途徑和劑量:本研究通過小鼠尾靜脈系統(tǒng)將生理鹽水或GF輔助的反義寡核苷酸藥物注射入6至8周齡的成年mdx小鼠體內(nèi),所有動物實驗均為單次尾靜脈注射。藥物劑量分別為:12.5mg/kg R-PMO兩周后收樣、25mg/kg R-PMO三周后收樣、15mg/kg Pip5e-PMO一周后收樣、20mg/kg Pip5e-PMO兩天以及20mg/kg B-MSP-PMO兩周后收樣,其中20mg/kg Pip5e-PMO為lissamine熒光標記藥物。在B-MSP-PMO系統(tǒng)試驗中,包含GF誘導(dǎo)組,通過每周一次單獨注射GF,持續(xù)注射4周,第5周再注射GF和B-MSP-PMO藥物。2.樣品收取:治療結(jié)束后,利用眼眶取血法獲取小鼠血液樣品,并通過靜置離心獲得血清。利用液氮冷凍收取小鼠心肌、前脛骨肌等6種骨骼肌;小腸等3種平滑肌以及腦組織。利用包氏液固定肝腎組織。3.Pip5e-PMO藥物組織分布情況檢測:利用小動物活體成像技術(shù)(IVIS)檢測熒光染料標記的20mg/kg Pip5e-PMO在mdx小鼠各組織內(nèi)的分布情況,并定量分析以確定GF對Pip5e-PMO組織攝取效率的影響。4.IHC檢測:利用免疫組化熒光染色來檢測不同藥物引起的dystrophin蛋白陽性肌纖維在各組織切片內(nèi)的分布和強度,以確定GF對不同藥物的增強作用。5.RNA水平上的檢測:利用RT-PCR技術(shù)來檢測RNA水平上不同AOs藥物引起的外顯子23跳讀水平,以確定GF對不同藥物在RNA水平上的跳讀提高作用。6.蛋白水平上的檢測:利用Western Blot技術(shù)來檢測不同藥物在各組織內(nèi)恢復(fù)的dystrophin蛋白表達水平,以確定GF對不同藥物在蛋白水平上的促進作用。7.肌肉功能恢復(fù)情況檢測:通過免疫組化熒光染色確定dystrophin蛋白相關(guān)復(fù)合物(DAPC)各蛋白成分在肌纖維膜上的重新定位情況和血清中CK-MB水平以評估心臟功能恢復(fù)情況;利用DAPC染色、血清中肌酸激酶CK含量測定、HE染色統(tǒng)計骨骼肌中中心核纖維(centrally nucleated myofibers-CNF)比例、CD3和CD68組化染色確定胸膈肌中免疫炎癥細胞數(shù)量以及抓力測試(grip strength)來評估骨骼肌功能改善程度。8.對B-MSP-PMO藥物相關(guān)毒副作用檢測:通過檢測血糖水平,以確定藥物注射對小鼠血糖濃度的影響;通過谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(CREA)等血清學指標檢測及HE染色等方法評估藥物潛在的毒副作用。結(jié)果:1.Pip5e-PMO組織分布檢測:小動物活體成像檢測和定量分析結(jié)果顯示,GF未能有效促進熒光標記的Pip5e-PMO在mdx各肌肉組織中的攝取。2.新型運輸輔助劑GF對三種不同AOs藥物在骨骼肌中的IHC檢測結(jié)果顯示:1)在12.5mg/kg的劑量下,R-PMO和GF共注射在骨骼肌中恢復(fù)的dystrophin陽性肌纖維數(shù)量接近正常水平,二組無明顯差異;同樣,在25mg/kg劑量下,兩個不同處理組在骨骼肌中介導(dǎo)的陽性肌纖維表達接近100%,二者之間未檢測到明顯差異。2)在GF對Pip5e-PMO作用效果的研究中,在不同劑量和治療周期下,Pip5e-PMO在骨骼肌中介導(dǎo)的dystrophin表達水平有差異。與20mg/kg Pip5e-PMO和GF共注射48h收樣組相比,15mg/kg Pip5e-PMO與GF共注射1周收樣組在骨骼肌中恢復(fù)的陽性肌纖維表達更高,但兩組均無明顯差異。3)在GF對B-MSP-PMO作用效果研究中,單次20mg/kg劑量下,三組在骨骼肌中均介導(dǎo)100%正常水平的dystrophin陽性肌纖維表達,且三組之間無明顯差異。3.新型運輸輔助劑GF對三種不同AO藥物在平滑肌中的IHC檢測結(jié)果顯示:1)兩種不同劑量的R-PMO介導(dǎo)小腸平滑肌中陽性肌纖維表達有限,且兩組之間無明顯差異;25mg/kg R-PMO在肺平滑肌中介導(dǎo)了一定數(shù)量的陽性肌纖維表達,兩組無顯著差異;R-PMO在25mg/kg的劑量下,在氣管平滑肌中介導(dǎo)較多的陽性肌纖維表達,且GF組顯著強于對照組。2)兩種劑量的Pip5e-PMO均未能在平滑肌中介導(dǎo)明顯的陽性肌纖維表達。3)20mg/kg B-MSP-PMO在平滑肌中介導(dǎo)數(shù)量較多的陽性肌纖維表達,三組在小腸和肺組織介導(dǎo)的陽性肌纖維表達無明顯差異;但在氣管平滑肌中,GF組和GF誘導(dǎo)組均高于生理鹽水組。4.新型運輸輔助劑GF對三種不同AO藥物在心肌中的IHC檢測結(jié)果顯示:1)在高劑量下,R-PMO在心肌中恢復(fù)的陽性肌纖維數(shù)量明顯增多,但兩組間無明顯差異。2)15mg/kg Pip5e-PMO一周收樣組和20mg/kg Pip5e-PMO 48小時收樣組在心肌中介導(dǎo)陽性肌纖維表達有限,且兩組無差異。3)20mg/kg B-MSP-PMO在心肌中介導(dǎo)了較多的陽性肌纖維表達,且GF組和GF誘導(dǎo)組明顯高于對照組。5.新型運輸輔助劑GF對三種不同AO藥物在骨骼肌中的RT-PCR檢測結(jié)果顯示:1)兩種不同劑量R-PMO均在骨骼肌中介導(dǎo)高效的外顯子跳讀,跳讀水平接近100%。2)15mg/kg和20mg/kg Pip5e-PMO在骨骼肌中分別介導(dǎo)平均水平在70%和90%的外顯子跳讀,但兩組間無差異。3)20mg/kg B-MSP-PMO在骨骼肌中介導(dǎo)外顯子23的完全跳讀,且三組之間無顯著差異。6.新型運輸輔助劑GF對三種不同AO藥物在平滑肌中的RT-PCR檢測結(jié)果顯示:1)高劑量R-PMO介導(dǎo)小腸平滑肌中的外顯子跳讀效率相比于低劑量明顯升高,但在兩種不同劑量下,GF組和對照組均無差異;在25mg/kg R-PMO注射的肺平滑肌中,GF組和生理鹽水組均表現(xiàn)出有限的外顯子跳讀效率,二者之間無明顯差別;但在氣管平滑肌中,GF組跳讀水平明顯高于對照組。2)兩種不同劑量的Pip5e-PMO在平滑肌中介導(dǎo)的外顯子跳讀水平都較低,生理鹽水組與GF組之間均無差異。3)20mg/kg B-MSP-PMO在小腸和氣管平滑肌中均能介導(dǎo)高效的外顯子跳讀,而在肺組織中的跳讀水平相對較低。與生理鹽水組相比,GF和GF誘導(dǎo)組在小腸和肺中無顯著差異;但在氣管中,GF組和GF誘導(dǎo)組跳讀水平明顯高于生理鹽水組。7.新型運輸輔助劑GF對三種不同AO藥物在心肌中的RT-PCR檢測結(jié)果顯示:1)劑量的上升使R-PMO在心肌中介導(dǎo)的外顯子跳讀水平升高,但兩組無明顯差異。2)在15mg/kg和20mg/kg兩種劑量下,GF在心肌中均未能提高Pip5e-PMO介導(dǎo)的外顯子跳讀水平。3)20mg/kg B-MSP-PMO在心肌中介導(dǎo)高效的外顯子23跳讀,且GF組和GF誘導(dǎo)組顯著高于生理鹽水組。8.新型運輸輔助劑GF對三種不同AO藥物在骨骼肌中的蛋白檢測結(jié)果顯示:1)12.5mg/kg R-PMO在骨骼肌中介導(dǎo)的dystrophin蛋白恢復(fù)水平約為70%,但生理鹽水和GF組之間無差異;25mg/kg R-PMO在不同骨骼肌中都誘導(dǎo)接近100%正常水平的dystrophin蛋白表達。2)15mg/kg Pip5e-PMO一周收樣處理組在骨骼肌中恢復(fù)的dystrophin表達水平約為50%,而20mg/kg Pip5e-PMO 48小時收樣處理組約為10%。在兩種劑量下,兩組均無明顯差異。3)20mg/kg B-MSP-PMO在骨骼肌中介導(dǎo)的dystrophin蛋白平均表達水平,在生理鹽水組中約為60%,在GF組和GF誘導(dǎo)組中為80%左右,稍高于生理鹽水組,但無顯著性差異。9.新型運輸輔助劑GF對R-PMO和B-MSP-PMO在平滑肌中的蛋白檢測結(jié)果顯示:1)12.5mg/kg R-PMO在小腸平滑肌中恢復(fù)dystrophin蛋白表達水平低于10%,而25mg/kg R-PMO處理組的dystrophin蛋白水平提高到20%以上,但兩種劑量的生理鹽水和GF組相比,均無差異;25mg/kg R-PMO在肺平滑肌中恢復(fù)dystrophin蛋白表達水平接近20%,二者之間無明顯差異;在氣管平滑肌中,GF顯著提高R-PMO活性,生理鹽水組蛋白水平僅為30%左右,而GF組則達到了50%以上。2)20mg/kg B-MSP-PMO在小腸和肺平滑肌中恢復(fù)dystrophin蛋白表達水平分別為正常水平的60%和20%,但三組間無明顯差異;在氣管平滑肌中,GF組dystrophin蛋白表達水平稍高于對照組,而GF誘導(dǎo)組則顯著高于對照組。10.新型運輸輔助劑GF對三種不同AO藥物在心肌中的蛋白檢測結(jié)果顯示:1)12.5mg/kg R-PMO在心肌中恢復(fù)約20%的dystrophin蛋白表達,生理鹽水和GF組之間無差異;25mg/kg R-PMO在心肌中恢復(fù)dystrophin蛋白表達水平為50%以上,GF組略高于生理鹽水組,但無顯著差異。2)15mg/kg Pip5e-PMO一周收樣組在心肌中介導(dǎo)10%左右的dystrophin蛋白表達,20mg/kg Pip5e-PMO 48小時收樣組dystrophin蛋白表達低于5%;但在兩種劑量下,生理鹽水和GF組均無明顯差異。3)20mg/kg B-MSP-PMO在心肌中介導(dǎo)的dystrophin蛋白表達水平在GF和GF誘導(dǎo)組均高于80%,而生理鹽水組為60%左右,GF和GF誘導(dǎo)組顯著高于生理鹽水組。11.B-MSP-PMO藥物對mdx小鼠肌肉功能恢復(fù)情況檢測分析:1)心肌IHC染色顯示:dystrophin在心臟中的表達恢復(fù),能夠使DAPC各蛋白成分重新定位于心肌細胞膜上;血清學檢測顯示:肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平低于未處理的對照小鼠,表明心肌細胞膜完整性有所提高。2)骨骼肌IHC染色顯示:DAPC各蛋白成分重新定位于骨骼肌肌纖維膜上;血清中肌酸激酶(CK)水平低于未處理對照組,提示骨骼肌肌纖維膜完整性有所提高。對小鼠骨骼肌中的中心核肌纖維和免疫炎癥細胞檢測結(jié)果顯示:與未處理組相比,B-MSP-PMO處理組中心核肌纖維和免疫炎癥細胞數(shù)量顯著降低,提示B-MSP-PMO能夠改善mdx小鼠肌肉再生和免疫環(huán)境。肌肉抓力測試結(jié)果表明:B-MSP-PMO處理組顯著高于未治療對照小鼠,提示肌肉整體功能的提高。12.對B-MSP-PMO藥物相關(guān)毒副作用檢測結(jié)果顯示:B-MSP-PMO與生理鹽水或GF的共同注射未引起血糖濃度的明顯波動;血清中肝功能標志物谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)等以及腎功能標志物尿酸(UA)等水平無明顯變化;HE染色顯示肝、腎細胞形態(tài)未發(fā)生可見病變,提示藥物治療并未導(dǎo)致明顯的毒副作用。結(jié)論:1.通過對新型運輸輔助劑GF與三種不同肽-PMO藥物在mdx小鼠上的系統(tǒng)測試,證明GF能增強肽-PMO類藥物在不同肌肉組織中的活性。2.GF與R-PMO在mdx小鼠上的系統(tǒng)研究結(jié)果表明,在飽和劑量下,GF在骨骼肌中對PMO活性增強作用效果不明顯,但顯著提高了R-PMO在氣管平滑肌中的作用效果。3.GF能夠提高B-MSP-PMO在mdx小鼠骨骼肌和氣管平滑肌中的活性;尤為重要的是,GF顯著增強B-MSP-PMO在心肌中的活性。4.GF重復(fù)使用能夠進一步提高核酸類藥物的運輸效率,且無明顯毒副作用,證明GF具有一定的有效性和安全性。
【關(guān)鍵詞】：杜興肌肉萎縮癥 運輸輔助劑GF 肽-PMO 外顯子跳讀 抗肌萎縮蛋白
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R746.4
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-18
• 縮略語18-19
• 前言19-25
• 研究現(xiàn)狀、成果19-24
• 研究目的、方法24-25
• 對象和方法25-38
• 1.1 實驗材料25-27
• 1.1.1 實驗動物25
• 1.1.2 測試反義寡核苷酸藥物名稱及序列25
• 1.1.3 主要儀器設(shè)備25-26
• 1.1.4 實驗試劑26-27
• 1.1.5 引物27
• 1.1.6 主要分析工具軟件27
• 1.2 實驗方法27-38
• 1.2.1 試劑配制27-30
• 1.2.2 動物注射30-31
• 1.2.3 組織RNA的提取31
• 1.2.4 One Step RT-PCR31-32
• 1.2.5 PCR擴增32-33
• 1.2.6 組織免疫熒光染色-dystrophin染色33
• 1.2.7 組織免疫熒光染色-nNOs蛋白染色33
• 1.2.8 dystrophin相關(guān)蛋白復(fù)合體免疫熒光染色33-34
• 1.2.9 蛋白的提取34
• 1.2.10 蛋白濃度測定34-35
• 1.2.11 蛋白雜交檢測35
• 1.2.12 病理檢測-蘇木精伊紅染色35-36
• 1.2.13 血清檢測36
• 1.2.14 抓力測試36
• 1.2.15 免疫炎癥反應(yīng)CD3~+T細胞和CD68~+巨噬細胞組織化學染色36-37
• 1.2.16 體內(nèi)分布測試37
• 1.2.17 定量分析dystrophin蛋白表達水平37
• 1.2.18 數(shù)據(jù)分析37-38
• 結(jié)果38-58
• 2.1 GF與R-PMO在mdx小鼠上的研究38-45
• 2.1.1 GF與R-PMO對mdx小鼠心肌的作用效果測試38-39
• 2.1.2 GF與R-PMO對mdx小鼠平滑肌的作用效果測試39-43
• 2.1.3 GF與R-PMO對mdx小鼠骨骼肌的作用效果測試43-45
• 2.2 GF與Pip5e-PMO在mdx小鼠上的研究45-50
• 2.2.1 GF與Pip5e-PMO對mdx小鼠心肌的作用效果測試45-47
• 2.2.2 GF與Pip5e-PMO對mdx小鼠平滑肌的作用效果測試47-48
• 2.2.3 GF與Pip5e-PMO對mdx小鼠骨骼肌的作用效果測試48-50
• 2.3 GF與B-MSP-PMO-PMO在mdx小鼠上的研究50-58
• 2.3.1 GF與B-MSP-PMO對mdx小鼠心肌的作用效果測試51
• 2.3.2 GF與B-MSP-PMO對mdx小鼠平滑肌的作用效果測試51-54
• 2.3.3 GF與B-MSP-PMO對mdx小鼠骨骼肌的作用效果測試54-55
• 2.3.4 GF與B-MSP-PMO對mdx小鼠肌肉功能恢復(fù)效果測試55-56
• 2.3.5 GF與B-MSP-PMO對mdx小鼠藥物相關(guān)毒副作用測試56-58
• 討論58-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻62-67
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明67-68
• 綜述 DMD環(huán)境下的肌肉線粒體異常研究進展68-79
• 綜述參考文獻76-79
• 致謝79-80
• 個人簡歷80

  本文關(guān)鍵詞：新型運輸輔助劑GF對肽-PMO在杜興肌肉萎縮癥小鼠上的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：281022