目的:研究ADAMDEC1(解聚素金屬蛋白酶家族癸蛋白1)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲、遷移和凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法:1.從上海吉?jiǎng)P基因公司提供的三種可能有效的慢病毒(分別攜帶TACCACGAAACCTGAGAACAT、CTGATAAGA AGCTTTGTGTTT、TCCCAGGAATCTTGTGAATTT三個(gè)基因片段)中篩選能夠下調(diào)U87細(xì)胞ADAMDEC1表達(dá)的慢病毒:(1)分別用三種慢病毒感染U87細(xì)胞,篩選最適復(fù)感染指數(shù)值(MOI),通過觀察GFP熒光的表達(dá)情況來(lái)判定轉(zhuǎn)染效率;(2)采用Real-time PC R法分別檢測(cè)三種慢病毒感染后U87細(xì)胞ADAMDEC1 mRNA的表達(dá)情況,并對(duì)三種慢病毒感染后U87細(xì)胞ADAMDEC1mRNA的表達(dá)差異進(jìn)行分析比較,篩選出能夠下調(diào)U87細(xì)胞ADAMDEC1表達(dá)的慢病毒;2.實(shí)驗(yàn)組(ADAMDEC1-RNAi)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞通過用篩選出的能夠下調(diào)U87細(xì)胞ADAMDEC1表達(dá)的慢病毒在最適復(fù)感染指數(shù)的條件下進(jìn)行感染來(lái)下調(diào)ADAMDEC1的表達(dá),對(duì)照組(CONTROL-RNAi)用陰性對(duì)照慢病毒(攜帶TTCTCCGAACGTG TCACGT基因片段)在最適復(fù)感染指數(shù)的條件下進(jìn)行感染,采用We stern blot法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞ADAMDEC1蛋白的定性、定量表達(dá)情況,并對(duì)轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞ADAMDEC1蛋白的表達(dá)差異進(jìn)行分析比較;3.采用CCK-8法檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖及黏附能力的差異,并對(duì)差異進(jìn)行分析比較;4.采用Transwell法檢測(cè)兩組細(xì)胞侵襲及遷移能力的差異,并對(duì)差異進(jìn)行分析比較;5.采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡情況的差異,并對(duì)差異進(jìn)行分析比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示,兩組間差異采用t檢驗(yàn)分析,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.通過觀察GFP熒光的表達(dá)情況可得知:上海吉?jiǎng)P基因公司提供的攜帶特異性基因片段的慢病毒能夠感染人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞,且最適復(fù)感染指數(shù)為20;2.Real-time PCR結(jié)果顯示:攜帶TCCCAGGAATCTTG TGAATTT基因片段的慢病毒感染人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞后,與對(duì)照組相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的U87細(xì)胞的ADAMDEC1-RNAi mRNA表達(dá)水平均明顯降低(P0.01),即TCCCAGGAATCTTGTGAATTT基因片段為下調(diào)ADAMDEC1基因表達(dá)的有效片段;3.CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示:攜帶有效基因片段的慢病毒感染人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞后,與對(duì)照組相比,下調(diào)ADAMDEC1表達(dá)后的U87細(xì)胞的增殖能力下降(P0.05),黏附能力明顯受到抑制(P0.01);4.Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示:攜帶有效基因片段的慢病毒感染人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞后,與對(duì)照組相比,下調(diào)ADAMDEC1表達(dá)后的U87細(xì)胞的侵襲和遷移能力均明顯下降(P0.01);5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:攜帶有效基因片段的慢病毒感染人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞后,與對(duì)照組相比,下調(diào)A DAMDEC1表達(dá)能夠促進(jìn)U87細(xì)胞的凋亡(P0.01)。結(jié)論:在體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中,下調(diào)ADAMDEC1表達(dá)能夠顯著抑制U87細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲、遷移能力,促進(jìn)U87細(xì)胞的凋亡。
【學(xué)位單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.4
【部分圖文】：

圖 1 U87 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率（A：明視野 100×；B：綠色熒光視野 100×）Fig.1 Transfection efficiency of U87 cells（A：bright field 100×；B：green fluorescent field 100×）AB

默情況t 法進(jìn)行蛋白表達(dá)量的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)中暗帶著色的深淺來(lái)判斷目的蛋同的情況下，暗帶的著色越深， Quantity-one 軟件對(duì) Western bl析，以此來(lái)對(duì)蛋白的表達(dá)量進(jìn)行R 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后 U87 細(xì)胞 ADAMDEC mRNA expression in U87 cells after trReal-time PCR CONTROL-RNAi 組比較，* P ＜0

AMDEC1 基因沉默表達(dá)對(duì) U87 細(xì)胞增殖能力的影響植相同計(jì)數(shù)的細(xì)胞，并分別用 ADAMDEC1-RNAi 及ROL-RNAi 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)，在特定時(shí)間測(cè)定特定波長(zhǎng)處 96 孔板各孔吸光度（OD 值），OD 值正比，即細(xì)胞計(jì)數(shù)越多，測(cè)得的 OD 值越大。CCK-8示：用ADAMDEC1-RNAi轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞后，U87細(xì)胞 3 Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后 U87 細(xì)胞 ADAMDEC1 蛋白的表達(dá).3 ADAMDEC1 protein expression in U87 cells after transfection deWestern blot與 CONTROL-RNAi 組比較，* P ＜0.01。

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