目的:研究ADAMDEC1(解聚素金屬蛋白酶家族癸蛋白1)對人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲、遷移和凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法:1.從上海吉凱基因公司提供的三種可能有效的慢病毒(分別攜帶TACCACGAAACCTGAGAACAT、CTGATAAGA AGCTTTGTGTTT、TCCCAGGAATCTTGTGAATTT三個基因片段)中篩選能夠下調(diào)U87細(xì)胞ADAMDEC1表達的慢病毒:(1)分別用三種慢病毒感染U87細(xì)胞,篩選最適復(fù)感染指數(shù)值(MOI),通過觀察GFP熒光的表達情況來判定轉(zhuǎn)染效率;(2)采用Real-time PC R法分別檢測三種慢病毒感染后U87細(xì)胞ADAMDEC1 mRNA的表達情況,并對三種慢病毒感染后U87細(xì)胞ADAMDEC1mRNA的表達差異進行分析比較,篩選出能夠下調(diào)U87細(xì)胞ADAMDEC1表達的慢病毒;2.實驗組(ADAMDEC1-RNAi)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞通過用篩選出的能夠下調(diào)U87細(xì)胞ADAMDEC1表達的慢病毒在最適復(fù)感染指數(shù)的條件下進行感染來下調(diào)ADAMDEC1的表達,對照組(CONTROL-RNAi)用陰性對照慢病毒(攜帶TTCTCCGAACGTG TCACGT基因片段)在最適復(fù)感染指數(shù)的條件下進行感染,采用We stern blot法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞ADAMDEC1蛋白的定性、定量表達情況,并對轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞ADAMDEC1蛋白的表達差異進行分析比較;3.采用CCK-8法檢測兩組細(xì)胞增殖及黏附能力的差異,并對差異進行分析比較;4.采用Transwell法檢測兩組細(xì)胞侵襲及遷移能力的差異,并對差異進行分析比較;5.采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測兩組細(xì)胞凋亡情況的差異,并對差異進行分析比較。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量數(shù)據(jù)以x±s表示,兩組間差異采用t檢驗分析,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1.通過觀察GFP熒光的表達情況可得知:上海吉凱基因公司提供的攜帶特異性基因片段的慢病毒能夠感染人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞,且最適復(fù)感染指數(shù)為20;2.Real-time PCR結(jié)果顯示:攜帶TCCCAGGAATCTTG TGAATTT基因片段的慢病毒感染人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞后,與對照組相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的U87細(xì)胞的ADAMDEC1-RNAi mRNA表達水平均明顯降低(P0.01),即TCCCAGGAATCTTGTGAATTT基因片段為下調(diào)ADAMDEC1基因表達的有效片段;3.CCK-8檢測結(jié)果顯示:攜帶有效基因片段的慢病毒感染人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞后,與對照組相比,下調(diào)ADAMDEC1表達后的U87細(xì)胞的增殖能力下降(P0.05),黏附能力明顯受到抑制(P0.01);4.Transwell檢測結(jié)果顯示:攜帶有效基因片段的慢病毒感染人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞后,與對照組相比,下調(diào)ADAMDEC1表達后的U87細(xì)胞的侵襲和遷移能力均明顯下降(P0.01);5.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:攜帶有效基因片段的慢病毒感染人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞后,與對照組相比,下調(diào)A DAMDEC1表達能夠促進U87細(xì)胞的凋亡(P0.01)。結(jié)論:在體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗中,下調(diào)ADAMDEC1表達能夠顯著抑制U87細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲、遷移能力,促進U87細(xì)胞的凋亡。
【學(xué)位單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.4
【部分圖文】：

圖 1 U87 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率（A：明視野 100×；B：綠色熒光視野 100×）Fig.1 Transfection efficiency of U87 cells（A：bright field 100×；B：green fluorescent field 100×）AB

默情況t 法進行蛋白表達量的檢測，實驗中暗帶著色的深淺來判斷目的蛋同的情況下，暗帶的著色越深， Quantity-one 軟件對 Western bl析，以此來對蛋白的表達量進行R 檢測轉(zhuǎn)染后 U87 細(xì)胞 ADAMDEC mRNA expression in U87 cells after trReal-time PCR CONTROL-RNAi 組比較，* P ＜0

AMDEC1 基因沉默表達對 U87 細(xì)胞增殖能力的影響植相同計數(shù)的細(xì)胞，并分別用 ADAMDEC1-RNAi 及ROL-RNAi 進行轉(zhuǎn)染，在實驗條件下培養(yǎng)，在特定時間測定特定波長處 96 孔板各孔吸光度（OD 值），OD 值正比，即細(xì)胞計數(shù)越多，測得的 OD 值越大。CCK-8示：用ADAMDEC1-RNAi轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞后，U87細(xì)胞 3 Western blot 檢測轉(zhuǎn)染后 U87 細(xì)胞 ADAMDEC1 蛋白的表達.3 ADAMDEC1 protein expression in U87 cells after transfection deWestern blot與 CONTROL-RNAi 組比較，* P ＜0.01。

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本文編號：2809343