目的:肌肉萎縮癥是一類致死性遺傳疾病,其中,臨床上較為常見的一類肌肉萎縮癥為杜興肌肉萎縮癥(Duchenne Muscular Dystrophy-DMD),是由DMD基因發(fā)生移碼突變導致其編碼的功能性dystrophin蛋白缺失所引起。臨床表現(xiàn)為進行性肌肉萎縮及認知能力下降,是一類神經(jīng)肌肉失調(diào)癥。另外一類較為常見的肌肉萎縮癥為dysferlin肌病,其臨床表征異質(zhì)性較高,是由于編碼跨膜蛋白dysferlin蛋白的DYSF基因發(fā)生突變,導致dysferlin蛋白表達下調(diào)而引起的一種肌肉萎縮癥,其發(fā)病時間較晚。臨床上針對肌肉萎縮癥的診斷,主要依賴于肌肉組織活檢,但該方法是一種侵入性強的診斷方法,對病人造成精神和身體上的傷害較大,因此,新型非侵入式的診斷策略研發(fā)迫在眉睫。同時臨床上對肌肉萎縮癥還缺乏行之有效的治療方法,亟需研發(fā)新型、高效和安全的治療手段和策略。近年來,外泌體(exosome)作為一種細胞分泌的天然生物納米級囊泡結(jié)構(gòu),其所具有的低免疫原性、來源廣泛和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等重要特性,尤其是exosome可攜帶源細胞來源的蛋白、脂類、m RNA和micro RNA等多種信息,因此可作為細胞信使,在疾病診斷與治療中顯示出巨大的應用潛力�；诖�,在本研究中,擬探究exosome在肌肉萎縮癥診療中的應用可行性和潛力,以期為肌肉萎縮癥診治提供一種新方法和策略。方法:從健康人和dysferlin肌病患者的血清和尿液中,利用超速離心的方法提取exosome,并利用電鏡、納米檢測儀和Western blot進行形態(tài)和表達譜鑒定。利用Western blot檢測并比較健康人和患者血清及尿液來源exosome中dysferlin蛋白的表達水平,以探究攜帶dysferlin的exosome是否可用于dysferlin肌病的診斷。利用ELISA檢測并比較血清和尿液來源exosome中dysferlin表達,以建立該方法的臨床診斷標準。利用Western blot檢測其他類型肌肉萎縮癥患者血清及尿液來源exosome攜帶相關(guān)功能蛋白的表達水平,以探究exosome在其他肌肉萎縮癥診斷的可行性。為探究exosome對肌肉萎縮癥的治療作用,分別在dysferlin肌病和DMD肌肉萎縮癥模型上進行了系統(tǒng)測試。在dysferlin肌病測試中,利用Western blot對不同細胞來源的exosome進行dysferlin表達鑒定,篩選高負載dysfelrin蛋白的exosome(EXOdysf)。利用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測PKH67標記的exosome在dysfelrin缺失細胞(DYSF-/-)內(nèi)的定位情況,采用Western blot及免疫熒光染色方法檢測exosome處理的細胞中dysferlin蛋白的表達及定位情況,以確認EXOdysf作為運輸載體的可行性及效率。將EXOdysf與DYSF-/-細胞共孵育48小時,利用雙光子激光掃描共聚焦顯微鏡對肌管膜進行損傷,以測試EXOdysf對DYSF-/-細胞膜損傷修復的作用;利用免疫熒光染色檢測受損DYSF-/-細胞膜表面溶酶體標志性蛋白LAMP-1的表達,以確定EXOdysf是否通過恢復dysferlin蛋白表達,從而促進溶酶體在細胞膜損傷修復過程中的作用;通過對細胞損傷修復過程熒光探針Fluo-3 AM標記的Ca2+流的變化,以探究EXOdysf是否可以調(diào)節(jié)膜損傷后Ca2+穩(wěn)態(tài)。利用CRISPR-Cas9基因組編輯系統(tǒng),對人DYSF基因外顯子22和55進行缺失突變,獲得dysferlin蛋白表達缺失的人細胞模型;將人血清來源exosome(EXOser)與dysferlin蛋白表達缺失細胞共孵育,利用Western blot檢測dysferlin蛋白的傳遞及表達;通過膜損傷修復試驗檢測血清來源exosome在人源細胞模型上對膜損傷修復的作用。在DMD模型的測試中,利用DMD疾病模型mdx小鼠,收集不同細胞來源exosome,按150μg/只exosome劑量,以腹腔注射的方式,每周注射兩次,連續(xù)注射3周。通過小鼠抓力的測試、血清肌酸激酶(CK)等方法來檢測肌肉功能是否得到改善。利用體重變化的監(jiān)測、肝臟和腎臟生化指標評估其安全性。利用HE肌肉病理切片染色、炎癥細胞標志性蛋白的免疫組織化學染色以及炎癥因子RT-PCR定量分析檢測肌肉組織病理上的改善情況。利用血清免疫球蛋白(Ig G)染色來探究肌細胞膜完整性的改變;利用Western blot檢測肌肉再生與分化相關(guān)的標志性蛋白的表達,以探究exosome對肌肉再生與分化功能的影響,并利用CTX急性損傷模型進行確認。通過Western blot和免疫熒光染色檢測dystrophin相關(guān)蛋白復合體的表達及定位,以探究exosome對dystrophin蛋白相關(guān)功能蛋白復合體的恢復情況。針對dystrophin蛋白功能復合體的表達恢復及正確定位,利用Western blot、RT-PCR和免疫熒光染色分別從蛋白轉(zhuǎn)運、m RNA水平改變、糖基化轉(zhuǎn)移酶表達水平以及胞內(nèi)蛋白酶體的表達及活性進行檢測,以闡釋exosome改善損傷肌肉功能的機制。結(jié)果:1.發(fā)現(xiàn)dysferlin肌病患者與健康人血清及尿液來源exosome上dysferlin蛋白表達呈現(xiàn)顯著性差異,證明血清及尿液來源exosome上dysferlin蛋白表達差異可作為dysferlin肌病的診斷指標;并建立了檢測血清exosome上dysferlin蛋白表達的ELISA方法,確立了其可用于dysferlin肌病臨床診斷范圍。2.通過對其他肌肉萎縮癥患者血清及尿液來源exosome上相關(guān)功能蛋白的檢測,為exosome用于相關(guān)疾病的臨床診斷提供了證據(jù)。3.對不同細胞來源exosome中dysferlin蛋白表達水平測試,發(fā)現(xiàn)H2K肌管來源exosome(EXOdysf)上dysferlin蛋白表達水平較高。進而對EXOdysf的標志蛋白表達、形態(tài)、大小表征及膜上的定位研究結(jié)果表明:EXOdysf表達exosome的標志蛋白CD63、Alix和CD9,呈現(xiàn)為茶托狀的納米級囊泡結(jié)構(gòu);dysferlin蛋白定位在exosome的膜及細胞質(zhì)內(nèi)。通過EXOdysf在DYSF-/-細胞中攝取和細胞內(nèi)定位試驗,結(jié)果表明:EXOdysf可高效地將所負載的dysferlin蛋白輸送到細胞內(nèi),并在細胞膜上正確定位,顯示出exosome可作為膜蛋白運輸載體的潛力。在DYSF-/-細胞模型上,對EXOdysf修復肌細胞膜損傷能力的測試,結(jié)果表明:EXOdysf通過恢復DYSF-/-細胞中dysferlin蛋白的表達,進而改善細胞膜損傷修復能力及溶酶體在膜損傷修復中的作用,并進一步調(diào)節(jié)肌肉細胞中Ca2+穩(wěn)態(tài)。在此基礎上,利用CRISPR-Cas9基因組編輯系統(tǒng),成功獲得了人DYSF基因外顯子22和55缺失突變的人源dysferlin蛋白缺失細胞模型。在兩個細胞模型上,通過測試人血清來源exosome(EXOser)對dysferlin蛋白缺失的人肌肉細胞膜損傷修復作用,結(jié)果表明:EXOser可高效介導dysferlin蛋白運輸及dysferlin蛋白缺失的人肌肉細胞膜損傷修復作用,并且EXOser適用于不同突變類型,具有普適性。4.在mdx小鼠模型上對不同細胞來源exosome系統(tǒng)測試結(jié)果顯示,不同細胞來源exosome均可顯著提高mdx小鼠抓力、顯著降低血清CK值,說明exosome能夠改善mdx小鼠肌肉功能。血生化分析結(jié)果顯示:與未治療組相比,治療組中肝臟和腎臟功能相關(guān)的生化指標無顯著性變化;在治療過程中,小鼠體重無明顯變化,說明exosome未表現(xiàn)出相關(guān)毒性。對exosomes治療的mdx小鼠中,不同肌肉病理檢測結(jié)果表明:exosome能夠改善肌纖維降解與壞死,降低炎癥因子表達,抑制炎癥細胞浸潤。通過檢測肌肉膜上血清免疫球蛋白的表達水平,發(fā)現(xiàn)exosome治療后肌肉膜上血清免疫球蛋白表達降低,說明exosome可改善肌細胞膜的完整性。在mdx及CTX急性損傷小鼠模型中,對exosome治療后肌肉肌纖維再生與分化相關(guān)蛋白的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):exosome能夠促進損傷肌肉的再生與分化;并且提高mdx小鼠肌肉中dystrophin相關(guān)功能蛋白復合體中dystroglycan和sarcoglycan蛋白表達及在肌肉膜上的正確定位。對其作用機制的研究結(jié)果表明:exosome可能通過抑制蛋白酶體的表達和活性,從而穩(wěn)定和提高mdx小鼠肌肉中dystrophin相關(guān)功能蛋白復合體表達和正確定位。結(jié)論:1.人血清和尿液來源的exosome可作為dysferlin肌病及其他相關(guān)肌肉萎縮癥新型的低/非侵入性診斷手段,為dysferlin肌病及其他相關(guān)肌肉萎縮癥臨床診斷提供了新工具。2.Exosome可作為膜蛋白的有效運輸載體,介導dysferlin蛋白的運輸和正確定位,并改善細胞膜損傷修復及膜內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的作用,為dysferlin肌病提供一種新治療策略和模式。3.Exosome可提高mdx小鼠肌肉功能,改善肌纖維膜的穩(wěn)定性和肌肉炎癥狀態(tài),促進肌纖維再生與分化,為DMD治療提供了一種新治療思路和模式。4.在mdx小鼠上,對exosome作用機制的初步研究表明:exosome可能通過抑制蛋白酶體表達和活性,從而穩(wěn)定骨骼肌及心肌中dystrophin相關(guān)蛋白復合體表達及其肌肉膜上的正確定位。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R746.4
【部分圖文】：

圖 1 dysferlin 和 dystrophin 蛋白結(jié)構(gòu)示意圖[7]二、Dysferlin 肌病治療研究概況目前，臨床上對 dysferlin 肌病缺乏有效的治療方法。盡管對 dysferlin 肌病的治療研究已經(jīng)開展，但是相對其他肌肉萎縮癥而言，對 dysferlin 肌病的治療研究還處于早期的階段。近年來，基因治療在肌肉萎縮疾病的治療中得到廣泛的關(guān)注和應用。研究表明，若在 dysferlin 肌病動物模型鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)入 dysferlin 基因的功能區(qū)域片段，該片段可表達出較全長 dysferlin 蛋白更短的但具有一定功能的 dysferlin 蛋白，并且表達的新 dysferlin 蛋白成功修復了損傷的肌細胞膜，但并未有效改善小鼠進行性的肌肉萎縮，提示了全長 dysferlin 蛋白對改善疾病發(fā)展進程的重要性[12, 13]。在基因治療的手段中，病毒常被用作基因的運輸載體然而由于病毒載體的容載量有限，全長 DYSF 基因的體內(nèi)運輸仍是一項很大的挑戰(zhàn)。盡管目前已有利用腺相關(guān)病毒（AAV）載體運輸全長或迷你 dysferlin 基因在非人模型上進行了功能測試[14, 15]，但 AAV 載體在體內(nèi)所引起的免疫原性問題限制了其在重復治療中的效果。法國 Bartoli 研究小組基于臨床病例，發(fā)現(xiàn)含有

天津醫(yī)科大學博士學位論文36-38]。值得一提的是，研究顯示，通過向表達淀粉樣前體蛋白沉淀模型小鼠腦內(nèi)注射負載淀粉酶的 exosome，可以有效地清除目的減少腦內(nèi)淀粉樣蛋白沉積及其介導的神經(jīng)毒性[39]。這些研究結(jié)果me 作為蛋白運輸載體在疾病治療中的應用潛力。研究表明，C2C12

圖 1 人血清來源 exosome 表征及 dysferlin 蛋白表達檢測（a）透射電子顯微鏡鑒定 EXOser 的形態(tài)與大小，標尺=100nm。（b）納米顆粒追蹤分析儀（NTA）檢測 EXOser 的粒徑大小分布（c）EXOser 蛋白表征檢測：exosome 標志性蛋白檢測和 dysferlin 表達豐度檢測。EXOdysf 為肌管來源exosome。1.2.2 人血清來源 exosome 在 dysferlin 疾病診斷中的研究為了探究血清來源 exosome 上的 dysferlin 蛋白表達是否可以達到區(qū)別健康人和 dysferlin 肌病患者的目的，首先我們收集了 3 例 dysferlin 肌病患者的血清并提取 exosome，將健康人血清來源 exosome 作為對照，利用 western blotting 檢測病人血清來源exosome中dysferlin蛋白的表達水平。結(jié)果顯示：在3例dysferlin肌病患者血清來源的 exosome 中均未檢測到 dysferlin 蛋白的表達，而在對照exosome 中，可以檢測到清晰的 dysferlin 蛋白表達條帶（圖 2 a）。由此表明，利用血清 exosome 中 dysferlin 蛋白的表達可以區(qū)別健康人和患者。

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本文編號：2809243