[背景]腦缺血是高發(fā)病率和高死亡率的主要病種,造成了醫(yī)療系統(tǒng)的巨大負(fù)擔(dān)。成功溶栓或者血管再通后可能造成更嚴(yán)重的繼發(fā)性腦組織損傷,即腦缺血/再灌注(I/R)損傷。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一種具有自我更新、多向分化能力的非造血干細(xì)胞,可通過直接分化或者分泌可溶性因子等旁分泌過程來減輕腦缺血后組織損傷,促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。最新研究表明,BMSCs的保護(hù)作用可能部分是通過調(diào)控自噬過程來實(shí)現(xiàn)的。自噬,是一個(gè)應(yīng)激性溶酶體降解途徑,可以通過消除細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器來維持細(xì)胞質(zhì)的穩(wěn)態(tài),在腦I/R損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不可或缺的作用。同時(shí),自噬也是一把雙刃劍,自噬在腦I/R損傷中的作用以及與BMSCs移植的關(guān)系仍需進(jìn)一步深究。[目的]探討自噬在腦I/R損傷中的作用,以及BMSCs移植對(duì)腦I/R損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響,并進(jìn)一步探索BMSCs移植與自噬的關(guān)聯(lián),進(jìn)而為BMSCs移植應(yīng)用于臨床腦缺血患者的治療提供更充分的理論依據(jù)。[方法]參照longa方法制備大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷(middle cerebral artery ischemia-reperfusion model,MCAO)模型。將造模成功的大鼠隨機(jī)分配到假手術(shù)組,MCAO 組,MCAO+BMSCs 組,MCAO+3-MA 組,MCAO+BMSCs+LY294002組,并根據(jù)再灌注后時(shí)間點(diǎn)分為12h、24h、48h、3d、5d及7d亞組。采用mNSS神經(jīng)功能障礙評(píng)分方法以及catwalk步態(tài)分析來進(jìn)行I/R大鼠神經(jīng)功能評(píng)估,應(yīng)用透射電鏡觀察大鼠腦缺血區(qū)域細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化及自噬體形成,Western blot檢測各組大鼠腦組織中自噬相關(guān)蛋白LC3II/I、Beclin-1、Akt/p-Akt以及mTOR/p-mTOR的表達(dá),HE染色觀察各組大鼠腦海馬組織形態(tài)變化,并應(yīng)用TUNEL檢測各組的神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況,TTC染色技術(shù)檢測大鼠腦梗塞面積的變化以及免疫熒光染色檢測各組腦組織LC3表達(dá)的變化。[統(tǒng)計(jì)學(xué)方法]應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組內(nèi)進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以p0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[結(jié)果]1.自噬在腦I/R損傷中的作用:與空白組相比,腦I/R大鼠海馬組織中可清晰地觀察到自噬體形成,呈多層膜狀結(jié)構(gòu),而且其海馬組織中LC3Ⅱ/Ⅰ比值以及Beclin-1表達(dá)明顯增加(p0.05);與MCAO組相比,3-MA組于術(shù)后mNSS評(píng)分均明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。HE染色顯示,3-MA組較MCAO組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞損傷明顯減輕,神經(jīng)細(xì)胞壞死數(shù)目明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2.在腦I/R損傷中BMSCs移植與自噬的關(guān)系:①BMSCs移植可減輕腦I/R大鼠腦損傷,促進(jìn)其神經(jīng)功能恢復(fù)TTC染色結(jié)果顯示,與MCAO組比較,MCAO+BMSCs組可明顯減少腦梗死體積,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);TUNEL檢測示腦I/R后12h至72小時(shí),TUNEL陽性神經(jīng)元逐漸增加,72小時(shí)達(dá)高峰,BMSCs組TUNEL陽性神經(jīng)元百分比明顯低于MCAO大鼠(p0.05);行為學(xué)結(jié)果分析示BMSCs+MCAO組較MCAO組大鼠mNSS評(píng)分降低,catwalk步態(tài)分析有明顯改善,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。②在腦I/R損傷中,BMSCs的神經(jīng)保護(hù)作用與抑制自噬過程有關(guān)透射電鏡下發(fā)現(xiàn)MCAO術(shù)后24h神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)典型的自噬體,術(shù)后72h可見細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量增多,并出現(xiàn)自噬溶酶體;腦I/R后腦組織中LC3Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin-1的表達(dá)量持續(xù)增加,移植后24h達(dá)高峰。而且,與MCAO組相比,BMSCs移植顯著降低了 LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);免疫熒光結(jié)果示在MCAO大鼠術(shù)后腦組織中LC3陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多(p0.05),而BMSCs移植則明顯減少了 LC3的表達(dá)。③BMSCs在腦I/R損傷的保護(hù)作用是與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活有關(guān)與sham組相比,腦I/R損傷減少了 p-Akt和p-mTOR的蛋白質(zhì)水平,然而,在BMSCs+MCAO組中,p-Akt和p-mTOR表達(dá)水平顯著增加(p0.05),LY294002的干預(yù)顯著降低了 p-Akt 和 p-mTOR 表達(dá)(p0.05)。而 BMSCs+MCAO+LY294002組中,LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)相對(duì)于BMSCs+MCAO組增加,差異均具有統(tǒng)計(jì)意義(p0.05)。[結(jié)論]1、腦I/R損傷可引起激活自噬,抑制自噬后可以減緩腦I/R損傷大鼠腦組織破壞,并改善其神經(jīng)功能障礙。2、BMSCs可以抑制神經(jīng)元細(xì)胞的自噬,從而促進(jìn)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。3、BMSCs的保護(hù)作用可能是通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活來抑制自噬實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R743.3
【部分圖文】：

２、自嗤相關(guān)蛋白分子ＬＣ３與Ｂｅｃｌｉｎ－Ｉ的表達(dá)逡逑ＬＣ３、Ｂｅｃｌｉｎ－１在空白１組腦組織中均有少量表達(dá)，其中ＬＣ３、Ｂｅｃｌｉｎ－１在逡逑腦缺血再灌注損傷后６ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ的表達(dá)均增高（圖２－３）。逡逑統(tǒng)計(jì)分析顯示，與空白１組相比，除模型１組再灌注后７２ｈ亞組外，其他逡逑時(shí)間亞組ＬＣ３ＩＩ／Ｉ比值（代表自噬程度強(qiáng)弱）明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＜０．０５）；逡逑與模型１組再灌注后２４ｈ亞組比較，其他時(shí)間亞組ＬＣ３ＩＩ／Ｉ比值降低，差異有統(tǒng)逡逑計(jì)學(xué)意義0＜０．０５；）。對(duì)于Ｂｅｃｌｉｎ－１的表達(dá)，與空白１組相比以及其他時(shí)間亞組相逡逑比，模型１組再灌注后２４ｈ亞組Ｂｅｃｌｉｎ－１的表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義逡逑（ｐ＜０．０５）。具體內(nèi)容見表２－２。逡逑空白組邋６ｈ邋１２ｈ邋２４ｈ邋４８ｈ邋７２ｈ逡逑ＬＣ３Ｈ邋ｉ邋ｔ：逡逑Ｉ－Ｃ３邋１邐—善逡逑Ｂｅｄｉｎ－１邐…逡逑！「邐s6y錝謾�、＇�

本文編號(hào)：2808802