【摘要】：目的缺血性腦卒中病理生理過程的復雜性和異質性,以及存在與其相關的多種合并癥,使得目前臨床中應用的各種神經保護藥物缺乏有效的治療效果。因此,發(fā)展出針對某一特定缺血性腦卒中患者亞群的靶向治療藥物已經成為缺血性腦卒中研究領域里的重要方向。2型糖尿病(type 2 diabetes,T2D)患者表現為一系列代謝異常,包括:高血糖、血脂異常及胰島素抵抗。缺血性腦卒中合并2型糖尿病的患者不僅死亡率成倍提高,并且神經功能預后更差。然而臨床中使用胰島素控制血糖水平并不能夠顯著改善2型糖尿病患者缺血性腦卒中的預后,提示僅僅通過調控代謝穩(wěn)態(tài)不足以有效治療這部分患者。更多新近的研究證據顯示糖尿病狀態(tài)下各種其他途徑也參與了缺血性腦損傷的加重,包括血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)通透性增加、神經促炎癥反應加重、神經退行性變以及認知功能損傷等。過氧化物酶增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)是一種重要的核內轉錄因子。它不僅參與調節(jié)機體糖脂代謝,在中樞神經系統各類細胞中也有表達,并且對缺血腦組織炎癥反應具有重要調控作用。成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21,rFGF21)作為一種重要的內分泌因子,可通過調節(jié)PPARγ活性發(fā)揮其多種作用,包括強力的代謝調控、組織保護及促組織修復的功能。本研究旨在評估在小鼠缺血性腦卒中合并2型糖尿病模型中,給予重組人FGF21(recombinant human fibroblast growth factor 21,rFGF21)對于腦缺血后神經促炎反應以及預后的作用。方法本研究使用瘦素受體(Leptin receptor,Lepr)缺陷誘導的雄性2型糖尿病模型小鼠(BKS.Cg-Dock7m+/+Lepr db/J homozygous mice,db/db mice)及其對應的非糖尿病對照雄性小鼠(BKS.Cg-Dock7m+/+Lepr db/J heterozygous mice,db/+mice)。采用大腦中動脈遠端永久性閉塞加90分鐘同側頸總動脈結扎法建立局灶性缺血性腦卒中模型(distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)。手術后6小時給予首次背部皮下rFGF21或生理鹽水注射,之后每天給予兩次相同劑量背部皮下注射(rFGF或生理鹽水,間隔時間至少8小時),直至處死。于腦缺血后相應時間點處死小鼠進行一系列相關檢測,一共包括兩個部分:1、糖尿病db/db小鼠共36只隨機分為三組:假手術組(n=12)、生理鹽水對照組(n=12),rFGF21治療組(n=12)。非糖尿病對照db/+小鼠共24只隨機分為兩組:假手術組(n=12)和生理鹽水對照組(n=12)。于第0(術前基礎水平)天及術后第1、3、5、7、10、14天檢測各組小鼠血糖及體重變化。于術前及術后第14天分別檢測各組小鼠糖化血紅蛋白水平。于手術后第14天取血清樣品檢測胰島素水平及脂聯素水平,取腦組織切片作蘇木精伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)測量梗死體積大小,神經髓鞘固藍染色(Luxol fast blue staining,LFB)測量神經髓鞘含量,免疫熒光(immunofluorescence,IF)檢測髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)及非磷酸化神經絲重鏈(non-phosphorylated neurofilament H,SMI-32)含量。于第0、1、3、5、7、14天分別使用粘貼物移除測試、拉力測試、足錯步測試及Y迷宮檢測各組小鼠感覺運動功能以及認知功能。此外,實驗還探究了rFGF21治療對于非糖尿病db/+小鼠腦缺血后的可能作用,指標包括:血糖及體重、感覺運動功能及梗死體積。2、糖尿病db/db小鼠共54只隨機分為三組:假手術組(n=18)、生理鹽水對照組(n=18),rFGF21治療組(n=18)。非糖尿病對照db/+小鼠共36只隨機分為兩組:假手術組(n=18)和生理鹽水對照組(n=18)。手術后第3天收取梗死周邊腦組織提取核蛋白檢測轉錄因子PPARγ-DNA結合活性。于第7天收取梗死周邊腦組織,采用實時定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測促炎因子及抗炎因子的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)水平,包括:腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、CC類趨化因子配體2(C-C motif chemokine ligand 2,CCL2)、IL-4、IL-10、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor-1,IGF-1)及轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)。收取全腦采用免疫熒光檢測梗死周邊M1型小膠質細胞數量及M2型小膠質細胞數量。結果1、相對于非糖尿病對照組小鼠,2型糖尿病小鼠腦缺血后表現出更為復雜的病理特點,包括:全身代謝異常,神經功能缺損加重,梗死體積擴大和白質完整性破壞加重。rFGF21治療顯著改善2型糖尿病小鼠腦缺血后代謝異常及神經功能缺損,減小梗死體積,減輕梗死周邊白質損傷及完整性破壞。rFGF21對于非糖尿病小鼠腦缺血后的梗死體積及神經功能預后改善不明顯,但也不導致非糖尿病小鼠發(fā)生低血糖及體重下降。2、腦缺血后3天,損傷周邊腦組織細胞核內PPARγ-DNA結合活性下降。相對于非糖尿病對照組小鼠,2型糖尿病小鼠腦缺血后損傷周邊腦組織細胞核內PPARγ-DNA結合活性下降更為顯著。腦缺血后7天,2型糖尿病小鼠梗死周邊神經促炎反應更強,M1型小膠質細胞極化明顯增加。rFGF21治療顯著提升損傷周邊腦組織細胞核內PPARγ-DNA結合活性,減輕2型糖尿病小鼠腦梗死周邊神經促炎反應及M1型小膠質細胞極化,并增加M2型小膠質細胞極化。結論rFGF21可能是一種新型的,基于疾病調修等多種作用的,針對缺血性腦卒中合并2型糖尿病的較為安全的候選治療方案。rFGF21發(fā)揮上述治療作用的機制可能是部分通過對系統性代謝進行調控以及促進與PPAR-γ活化相關的抗炎作用得以實現的。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R743.3;R587.2
【圖文】：

間點上（術前基礎水平，術后第）對小鼠分別進行了血糖（圖.2）測試。糖尿病 db/db 小鼠的血糖和體重無論是基礎水平值（O 過后的測值均明顯高于非糖尿病對照 db/+小鼠（p<0.05），存在高血糖。rFGF21 連續(xù)治療能夠顯著降低 db/db 小鼠 dMCAp<0.05），非 dMCAO 狀態(tài)下，db/db 小鼠但是本實驗所用 rF 小鼠體重并無明顯影響。糖化血紅蛋白的測定結果（圖 1.2）也基礎糖化血紅蛋白值就明顯高于 db/+小鼠（p<0.05）。而 dM/db 小鼠糖化血紅蛋白測值也顯著高于 dMCAO 后的 db/+小鼠（db 小鼠在 dMCAO 后存在持續(xù)的高血糖狀態(tài)。而給予 rFGF21 治 小鼠 dMCAO 后的糖化血紅蛋白水平。肥胖是糖尿病 db/db 小鼠我們觀察到 11 周齡左右的糖尿病 db/db 小鼠體重顯著高于非糖（p<0.05）。dMCAO 后各組小鼠體重無明顯變化，而長期接療的 dMCAO 后糖尿病 db/db 小鼠體重無明顯下降（圖 1.3）。

圖 1.2 rFGF21 降低糖尿病小鼠腦缺血后糖化血紅蛋白水平e 1.2 rFGF21 lowered the HbA1c level in diabetic db/db mice after d.$p<0.05 db/+ sham vs db/db sham,*p < 0.05 stroke vs sham,#p<0.05vs db/+ stroke,&p<0.05 db/db stroke+rFGF21 vs db/db stroke)圖 1.3 rFGF21 對糖尿病小鼠腦缺血后體重無明顯影響

重慶醫(yī)科大學博士研究生學位論文圖 1.2 rFGF21 降低糖尿病小鼠腦缺血后糖化血紅蛋白水平re 1.2 rFGF21 lowered the HbA1c level in diabetic db/db mice after dp.$p<0.05 db/+ sham vs db/db sham,*p < 0.05 stroke vs sham,#p<0.05vs db/+ stroke,&p<0.05 db/db stroke+rFGF21 vs db/db stroke)

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本文編號：2806119