【摘要】：背景缺血性腦卒中是指由于腦的供血動脈(頸動脈或椎動脈系統(tǒng))狹窄或閉塞、腦供血不足導致的腦組織壞死的總稱。我國是全世界卒中發(fā)病率最高的國家之一,現(xiàn)有腦卒中患者10×10~6例,其中約85%為缺血性腦卒中,這無疑給患者及社會帶來沉重的負擔和極大的痛苦。我國是人口大國,缺血性腦卒中發(fā)病率逐年攀升、且復發(fā)率高于全球平均水平,嚴重影響了國民生存及生活質(zhì)量。缺血性腦卒中的發(fā)病機制復雜,涉及炎癥反應、興奮性氨基酸毒性、Ca~(2+)超載、氧化應激損傷等多種機制。越來越多的研究顯示,炎癥反應在缺血性腦卒中的發(fā)生、進展及轉(zhuǎn)歸中起著重要的作用,炎癥反應可誘導神經(jīng)元凋亡、破壞血腦屏障的完整性以及加重腦組織水腫等,因此,減輕炎癥反應,防治炎性損傷已成為改善缺血性腦卒中預后的研究方向和治療策略。脂氧素(lipoxins,LXs)是機體在炎癥反應中產(chǎn)生的一種內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì),具有強大抗炎、促炎癥消退的作用。近年來一些研究初步顯示LXA4對缺血性腦卒中有保護作用,但其作用的內(nèi)在機制和確切環(huán)節(jié)尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),小膠質(zhì)細胞在缺血性腦卒中的炎癥反應中起著重要作用,小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐巨噬細胞,在缺血性腦卒中后可被迅速激活,激活后的小膠質(zhì)細胞主要存在M1型和M2型兩種極化狀態(tài),分別發(fā)揮促炎及抗炎雙重作用。在缺血性腦卒中發(fā)病過程中LXA4是否能夠調(diào)控小膠質(zhì)細胞的極化進而達到抗炎和減輕炎癥損傷作用及其相關(guān)機制尚不清楚,至今未見相關(guān)研究報道。本研究擬從動物和細胞水平研究LXA4對腦缺血再灌注損傷后小膠質(zhì)細胞極化的影響,并初步探討其可能的機制,旨在為臨床治療缺血性腦卒中提供新的思路,為LXA4治療缺血性腦卒中提供新的依據(jù)。目的1.觀察LXA4在腦缺血再灌注損傷過程中的抗炎及神經(jīng)功能保護的作用。2.闡明LXA4對腦缺血再灌注損傷后小膠質(zhì)細胞極化的影響。3.探討LXA4對腦缺血再灌注損傷過程中對小膠質(zhì)細胞極化調(diào)控的分子機制。方法1.體內(nèi)運用改良的線栓法構(gòu)建大鼠大腦中動脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注損傷模型,模型建立后立即通過側(cè)腦室注射LXA4進行干預,缺血2小時后拔出線栓實現(xiàn)再灌注,在既定的時間點進行后續(xù)的實驗。2.體外培養(yǎng)BV-2小膠質(zhì)細胞,構(gòu)建氧糖剝奪/復氧(Oxygen sugar deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型并給予LXA4預處理,氧糖剝奪處理BV2小膠質(zhì)細胞6小時,復糖復氧12小時后進行后續(xù)的實驗。3.通過Longa法進行神經(jīng)功能學評分、TTC染色觀察腦梗死及水腫體積的大小、HE染色觀察梗死的損傷程度及病理變化及TUNEL染色觀察梗塞灶周圍神經(jīng)元凋亡的情況。4.免疫熒光觀察激活后小膠質(zhì)細胞的形態(tài)變化。5.RT-PCR和ELISA分別檢測炎癥因子IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表達情況。6.RT-PCR、Western-blot和免疫熒光分別檢測iNOS和CD32(M1型極化標志物)、Arg-1和CD206(M2型極化標志物)的mRNA和蛋白表達情況。7.RT-PCR和Western-blot檢測Notch信號通路相關(guān)的Notch-1、Hes-1及Hes-5的mRNA和蛋白表達情況。結(jié)果1.在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型中,通過行為學評分、TTC染色、HE染色及TUNEL染色,明顯觀察到側(cè)腦室注射LXA4可顯著降低大鼠神經(jīng)行為學評分、梗死和水腫體積、神經(jīng)元壞死及凋亡。2.Iba1免疫熒光結(jié)果顯示,靜息態(tài)的小膠質(zhì)細胞呈現(xiàn)小胞體,高度分枝狀,激活后的小膠質(zhì)細胞胞體變大,突起變短,呈球狀的“阿米巴狀”,LXA4干預后可輕度抑制小膠質(zhì)細胞的激活,但大多數(shù)細胞形態(tài)仍呈“阿米巴狀”。3.體內(nèi)大鼠MCAO后24h和體外BV2小膠質(zhì)細胞OGD/R12h后,IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表達量均顯著升高(P0.05),LXA4進行干預后,IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表達量均下降(P0.05)。4.體內(nèi)大鼠MCAO后第3天和體外BV2小膠質(zhì)細胞OGD/R12h后,M1型Marker(iNOS、CD32)和M1型Marker(Arg-1、CD206)的mRNA及蛋白表達量均升高(P0.05);LXA4干預后,M1型Marker CD32的mRNA及蛋白表達量均下降(P0.05),M1型Marker iNOS的蛋白表達量下降(P0.05),mRNA的表達量無明顯變化(P0.05),M2型Marker(Arg-1、CD206)的mRNA及蛋白表達量均升高(P0.05);體外BV2小膠質(zhì)細胞OGD/R12h后iNOS和Arg-1、CD32與CD206的免疫熒光雙染結(jié)果與上述一致。5.體內(nèi)大鼠MCAO后第3天和體外BV2小膠質(zhì)細胞OGD/R12h后Notch信號通路相關(guān)蛋白Notch-1、Hes-1和Hes-5的mRNA和蛋白表達量均升高(P0.05),LXA4干預后,Notch-1和Hes-1的mRNA和蛋白表達量下降(P0.05),Hes-5的mRNA和蛋白表達量升高(P0.05)。結(jié)論1.LXA4可降低大鼠腦缺血再灌注損傷后梗死體積并減輕其神經(jīng)功能損傷。2.LXA4可抑制大鼠腦缺血再灌注損傷后及體外培養(yǎng)的氧剝奪復氧后的BV2小膠質(zhì)細胞的炎癥反應和炎癥因子的表達。3.LXA4可調(diào)控腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織中的小膠質(zhì)細胞及體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞的極化,抑制其向M1型極化、促進其向M2型極化。4.LXA4對腦缺血再灌注及氧剝奪后復氧的小膠質(zhì)細胞極化的調(diào)控可能是通過Notch信號通路實現(xiàn)的。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R743
【圖文】：

用介導的[2, 10, 11]。Notch 受體表達于細胞膜表面，因此可被解聯(lián)蛋白和酶（ADAM）17 或-10 和早老素依賴性 γ-分泌酶復合物切割。切割后位至細胞核，并與轉(zhuǎn)錄因子 CSL 相互作用，從而激活下游靶基因[12CSL 單獨存在時作為轉(zhuǎn)錄抑制劑來抑制靶基因的表達，但在與 NICD導相應基因的轉(zhuǎn)錄。

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本文編號：2805653