發(fā)布時(shí)間：2020-08-24 08:13

【摘要】：[研究背景]帕金森病(Parkinson's disease)是由錐體外系功能紊亂而導(dǎo)致的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其臨床表現(xiàn)為靜止震顫,肌肉僵直,運(yùn)動(dòng)遲緩和共濟(jì)失調(diào),嚴(yán)重者伴有記憶障礙和癡呆;帕金森病典型的病理特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性缺失,紋狀體內(nèi)多巴胺能遞質(zhì)含量顯著減少,以及在殘存的多巴胺能神經(jīng)元內(nèi),a-synuclein的聚集導(dǎo)致的路易小體的形成。帕金森病的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,可能涉及到了氧化應(yīng)激、炎癥損傷、興奮性神經(jīng)毒性、線(xiàn)粒體功能障礙及遺傳因素等,目前已經(jīng)提出了多種假說(shuō),但至今沒(méi)有定論。氧化應(yīng)激及免疫炎癥反應(yīng)在PD多巴胺能神經(jīng)元損傷中發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用。活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的過(guò)度產(chǎn)生、固有免疫的過(guò)度激活及適應(yīng)性免疫功能紊亂,會(huì)導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元處于持續(xù)刺激狀態(tài),它們共同構(gòu)成了黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)區(qū)域的病理微環(huán)境,是引起多巴胺能神經(jīng)元變性損傷的主要機(jī)制。然而,迄今為止其上下游分子調(diào)控機(jī)制仍未得到充分闡明。近年,有研究表明組蛋白乙�；揎椀缺碛^遺傳機(jī)制在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用,影響細(xì)胞多方面功能,參與PD的發(fā)生發(fā)展。組蛋白去乙�；�6(histone deacetylase 6，HDAC6)的去乙�；钚栽谘趸瘧�(yīng)激及免疫炎癥反應(yīng)中的作用日益受到重視。HDAC6屬于2類(lèi)HDAC家族,結(jié)構(gòu)獨(dú)特,包括兩個(gè)去乙�；呋�、一個(gè)泛素化結(jié)合域以及一個(gè)動(dòng)力蛋白結(jié)合域。兩個(gè)去乙�；呋�(DD1,DD2)是HDAC6的酶活性區(qū)域,均有使底物蛋白去乙�；幕钚�,其中DD2的功能特征較為明確,是目前HDAC6特異性抑制劑的作用靶位。過(guò)氧化氧化還原蛋白Prx是HDAC6的特異性底物。經(jīng)HDAC6去乙�；{(diào)節(jié)后,即去乙�；腜rx,其抗氧化能力大大降低,細(xì)胞死亡率增加,不利于氧化性損傷的防治。由于氧化損傷是帕金森病的重要致病因素,因此,本實(shí)驗(yàn)用HDAC6去乙�；钚蕴禺愋砸种苿㏕ubastatinA(TBA),觀察在6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型中,TBA對(duì)HDAC6去乙�；钚缘囊种�,以及對(duì)氧化損傷的保護(hù)作用。除氧化應(yīng)激外,固有免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)也是帕金森病的一個(gè)重要的致病因素。NLRP3即NOD樣受體屬于胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體,通過(guò)識(shí)別受損細(xì)胞釋放的損傷相關(guān)分子模式,激活固有免疫系統(tǒng)、促進(jìn)炎癥并驅(qū)動(dòng)和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。研究表明ROS可以作為一種內(nèi)源性致病因素,啟動(dòng)NALP3炎性體(inflammasome)裝配,進(jìn)而激活caspase-1,誘導(dǎo)IL-1β、IL-18等前體分子的成熟分泌及細(xì)胞死亡,參與非感染性疾病的發(fā)生發(fā)展,在免疫炎癥反應(yīng)及中樞神經(jīng)退行性疾病中的作用日益受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)采取HDAC6去乙�；钚缘奶禺愋砸种苿㏕BA,觀察在6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型中,TBA抑制HDAC6去乙�；钚院�,對(duì)NLRP3激活的影響,以及NLRP3激活后,對(duì)NLRP3炎性小體的裝配、后續(xù)相關(guān)炎癥因子如caspase-1、IL-1β等分子的成熟及分泌的影響。[研究目的]利用TBA特異性抑制HDAC6去乙�；钚�,觀察對(duì)NLRP3通路的影響及在帕金森病中的作用。[研究方法]體外實(shí)驗(yàn):1.體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,給予6-OHDA刺激SH-SY5Y細(xì)胞,不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞,western blot觀察NLRP3的蛋白表達(dá)變化。2.體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行TBA預(yù)處理2 h及6-OHDA刺激24 h，western blot觀察NLRP3及caspase-1、IL-1β活化體的表達(dá)變化。3.體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,給予不同濃度TBA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行處理,CCK-8觀察TBA對(duì)細(xì)胞的增殖是否有影響,并觀察TBA對(duì)6-OHDA損傷的細(xì)胞是否起到保護(hù)作用。4.體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行TBA預(yù)處理2h及6-OHDA刺激24 h,流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL熒光染色觀察TBA對(duì)細(xì)胞凋亡是否起到保護(hù)作用。5.體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,制備相應(yīng)小干擾及過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行沉默或過(guò)表達(dá)HDAC6分子,驗(yàn)證其沉默或過(guò)表達(dá)的效率后,流式細(xì)胞術(shù)觀察其對(duì)細(xì)胞凋亡是否有影響。6.體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行TBA預(yù)處理2 h及6-OHDA刺激24 h,免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)觀察TBA對(duì)Prx-II乙�；降挠绊�,流式細(xì)胞術(shù)觀察TBA對(duì)細(xì)胞ROS水平的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):1.使用腦立體定位儀對(duì)C57BL/6小鼠大腦定位注射6-OHDA制備帕金森病動(dòng)物模型,第二天開(kāi)始腹腔注射TBA(25 mg/kg)治療,每日一次,連續(xù)給藥7天,末次給藥后取小鼠黑質(zhì)部位冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色,觀察NLRP3和HDAC6在神經(jīng)元部位的表達(dá)。2.使用腦立體定位儀對(duì)C57BL/6小鼠大腦定位注射6-OHDA制備帕金森病模型,取小鼠紋狀體部位組織,用western blot及real time RT-PCR觀察造模后不同時(shí)間點(diǎn)NLRP3mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化。3.使用腦立體定位儀對(duì)C57BL/6小鼠大腦定位注射6-OHDA制備帕金森病模型,腹腔注射TBA治療,取小鼠紋狀體部位的組織,用westem blot及real time RT-PCR觀察NLRP3、caspase-1、TH、IL-18、IL-1β、IL-6的蛋白或mRNA水平的表達(dá)變化。4.使用腦立體定位儀對(duì)C57BL/6小鼠大腦定位注射6-OHDA制備帕金森病模型,腹腔注射TBA治療,取小鼠黑質(zhì)部位冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色,觀察TBA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及表達(dá)變化的影響,取小鼠黑質(zhì)部位及紋狀體部位冰凍切片進(jìn)行免疫組化染色,觀察TBA對(duì)多巴胺能神經(jīng)元是否有保護(hù)作用。5.使用腦立體定位儀對(duì)C57BL/6小鼠大腦定位注射6-OHDA制備帕金森病模型,腹腔注射TBA治療,取小鼠紋狀體部位組織,用HPLC-MS檢測(cè)TBA對(duì)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA含量的影響。6.使用腦立體定位儀對(duì)C57BL/6小鼠大腦定位注射6-OHDA制備帕金森病模型,腹腔注射TBA治療,取小鼠黑質(zhì)部位冰凍切片及小鼠紋狀體部位組織,使用免疫熒光染色及western blot,觀察TBA對(duì)4-HNE表達(dá)的影響。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]1.特異性HDAC6抑制劑TBA抑制SH-SY5Y細(xì)胞中6-OHDA誘導(dǎo)的NLRP3炎性體活化。2.TBA對(duì)HDAC6的藥理性抑制可保護(hù)6-OHDA損傷的SH-SY5Y細(xì)胞,減少6-OHDA所致細(xì)胞死亡,敲低或過(guò)表達(dá)HDAC6對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)影響。3.在6-OHDA誘導(dǎo)的PD小鼠模型中,TBA抑制NLRP3炎性體的活化。4.TBA減輕小鼠PD模型中6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)毒性。5.TBA增強(qiáng)PRX-Ⅱ的乙�；讲⒔档图�(xì)胞與動(dòng)物模型內(nèi)的ROS水平。[結(jié)論]TBA特異性抑制HDAC6去乙�；�,通過(guò)減少氧化應(yīng)激及炎癥損傷,在帕金森病中起到保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R742.5

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本文編號(hào)：2802214