【摘要】：背景和目的腦小血管病(cerebral small vessel disease,CSVD)指累及小動脈、微動脈、毛細(xì)血管、微靜脈、小靜脈等沒有側(cè)支吻合的解剖終末血管,導(dǎo)致的一系列臨床、影像、病理綜合征。有研究顯示西方國家缺血性腦卒中患者中約25%為CSVD,國內(nèi)約50%。腦小血管病變常導(dǎo)致腦內(nèi)腔隙性梗死、白質(zhì)變性、微出血、皮質(zhì)下小梗死、腦萎縮等損害,患者常表現(xiàn)頭暈、眩暈、步態(tài)障礙、認(rèn)知功能減退等癥狀。目前腦血管病的動物模型大多為急性腦缺血模型,慢性腦缺血模型較少,尤其是穩(wěn)定的CSVD動物模型。構(gòu)建一種模擬臨床CSVD患者的慢性腦缺血動物模型,對于CSVD的發(fā)病機(jī)制及治療研究具有重要的意義。單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK))是細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)器。大多數(shù)研究表明AMPK在急性腦缺血時被激活,腦ATP消耗加速,從而加重腦缺血損傷,尤其是缺血半暗帶區(qū)的損傷。而在慢性腦缺血過程中,AMPK的作用機(jī)制尚不明確,有人認(rèn)為,AMPK激活在慢性腦缺血中起腦保護(hù)作用,也有人認(rèn)為其會加重慢性腦缺血損傷。本課題通過觀察AMPK在慢性腦缺血中的作用并探索其作用機(jī)制,為尋找CSVD更有效的治療靶點(diǎn)提供新思路。方法1、采用內(nèi)徑0.18mm的微彈簧套扎3月齡雄性C57BL/6小鼠的雙側(cè)頸總動脈,造成雙側(cè)頸總動脈狹窄(Bilateral common carotid artery stenosis,BCAS),實(shí)現(xiàn)小鼠慢性腦缺血,術(shù)中監(jiān)測腦血流。假手術(shù)組僅分離小鼠雙側(cè)頸總動脈,不套微彈簧。術(shù)后1個月和3個月,采用Morris水迷宮等方法檢測小鼠的認(rèn)知功能。處死前進(jìn)行頭顱核磁共振(Magnetic resonance imaging,MRI)檢查,取腦組織行石蠟固定,切片染色檢測組織學(xué)改變。2、BCAS術(shù)后小鼠每天用AMPK激動劑二甲雙胍(Metformin,Met)(按照250mg/kg劑量)灌胃。灌藥后1月和3月行Morris水迷宮等行為學(xué)檢測。處死前進(jìn)行頭顱MRI檢查,取腦組織行石蠟固定,切片染色檢測組織學(xué)改變。3、采用Cre-loxp重組酶系統(tǒng)構(gòu)建AMPKα2基因敲除小鼠,用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)、Western blot、免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)等技術(shù)驗(yàn)證基因敲除效果。3月齡雄性AMPKα2基因敲除小鼠行BCAS術(shù),同法進(jìn)行小鼠行為學(xué)和組織學(xué)檢測腦損傷情況。結(jié)果1、微彈簧套扎小鼠雙側(cè)頸總動脈后,小鼠出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶能力減退,并隨著缺血時間延長而逐漸加重。小鼠腦組織出現(xiàn)了脫髓鞘、星型膠質(zhì)細(xì)胞增生和少突膠質(zhì)細(xì)胞減少、神經(jīng)元凋亡等慢性腦缺血損傷改變。以上結(jié)果表明用微彈簧對小鼠行BCAS術(shù)可造成小鼠慢性腦缺血,成功制備小鼠慢性腦缺血模型。2、BCAS術(shù)后,用AMPK激活劑二甲雙胍對小鼠進(jìn)行灌胃,發(fā)現(xiàn)二甲雙胍組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力減退較對照組小鼠輕,腦組織脫髓鞘、膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)增生和神經(jīng)元凋亡也較對照組小鼠輕。表明激活A(yù)MPK可改善BCAS術(shù)制備的小鼠慢性腦缺血損傷。3、與BCAS術(shù)后的野生型(Wide type,WT)C57BL/6雄性小鼠相比,AMPKα2基因敲除的雄性小鼠術(shù)后學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退,腦組織慢性腦缺血損傷明顯,尤其是膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生。表明AMPK功能的缺失會加重小鼠慢性腦缺血損傷。結(jié)論1、微彈簧套扎雙側(cè)頸總動脈能夠成功制備小鼠慢性腦缺血模型。2、激活小鼠AMPK活性具有抗慢性腦缺血損傷的作用。3、敲除小鼠AMPKα2基因功能會加重慢性腦缺血損傷。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R743
【圖文】：

儀(新加坡 BIO-RAD)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國 Fluorchem）配制磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，l，14.4g Na2HPO4，2.7g KH2PO4,溶于 800m pH 值至 7.4,最后加蒸餾水定容至 1L。甲醛：40g 多聚甲醛，用 0.1MPBS 加熱溶解，0.1MPBS 定容至 1L。和分組月齡清潔級 C57BL/6 雄性小鼠，篩選體重為 2rris 水迷宮篩選

圖 2 小鼠雙側(cè)頸總動脈套扎微彈簧組小鼠小鼠同樣方法分離雙側(cè) CCA，不進(jìn)行微彈監(jiān)測1 月和 3 月分別進(jìn)行 1 次 Morris 水迷宮檢測（同交替和新奇目標(biāo)識別檢測。自發(fā)交替，Y 迷宮三個臂隨機(jī)設(shè)為 1、2、3，老探索 5min，依次記錄小鼠進(jìn)入每個臂的順序號、總交替數(shù)（含連續(xù)三個臂序號的三聯(lián)串總次數(shù)能交替數(shù)（進(jìn)入各個臂的總次數(shù) 2）×100％。新奇目標(biāo)識別，Y 迷宮三個臂隨機(jī)設(shè)為新奇臂（，其中新奇臂先用擋板隔離。老鼠由起始臂放入5min，4h 后，打開新奇臂，小鼠由起始臂放入，

分別為術(shù)后1月和術(shù)后3月的Morris水迷宮小鼠訓(xùn)練1-5天平均逃避較 平均游泳速度比較S術(shù)后1月和術(shù)后3月，Morris水迷宮第6天，假手術(shù)組和BCAS組小鼠度比較，反映小鼠術(shù)后的運(yùn)動能力。假手術(shù)組和BCAS組小鼠術(shù)后1比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后3月，可看出BCAS組小速度較慢，但差異未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖4）。020406080100nsnsregaewsimmingspe(dcm/s）

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2799597