【摘要】：研究背景腦室出血(intraventricular hemorrhage,IVH)是血液進入腦室系統(tǒng)而引起的常見的神經(jīng)外科疾病,分為原發(fā)性IVH和繼發(fā)性IVH。原發(fā)性IVH主要是指脈絡(luò)叢血管破裂引起的出血,比較少見。而腦實質(zhì)內(nèi)的出血如腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)和蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)破入腦室稱之為繼發(fā)性IVH,比較常見。大約40%的ICH患者和高達70%的SAH患者合并IVH,IVH的出現(xiàn)與ICH和SAH患者高死亡率密切相關(guān),而且也是ICH和SAH患者神經(jīng)功能障礙發(fā)生的重要因素。然而,目前IVH損傷的機制研究并不透徹,明確IVH后腦損傷的發(fā)生機制及探索可能有效的干預(yù)靶點對于改善IVH患者的預(yù)后具有十分重大的意義。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是由灰質(zhì)和白質(zhì)構(gòu)成,灰質(zhì)和白質(zhì)大約各占50%�；屹|(zhì)主要是由神經(jīng)元的胞體和無髓鞘的軸突組成,而白質(zhì)則是由髓鞘包裹的軸突和支持細胞組成,這些支持細胞主要有少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞組成。普遍認為白質(zhì)的功能主要是協(xié)調(diào)灰質(zhì)間聯(lián)系和神經(jīng)活動。越來越多的臨床醫(yī)生和基礎(chǔ)研究的學(xué)者認為白質(zhì)損傷在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中存在,而且白質(zhì)損傷與患者的預(yù)后密切相關(guān)。但是,IVH后是否存在白質(zhì)損傷及其損傷機制尚未有深入的探討。血液成分及其代謝產(chǎn)物在出血性腦卒中后的腦損傷發(fā)揮著重要作用。出血性腦卒中,一方面紅細胞在補體活化和膜攻擊復(fù)合物(membrane attack complex,MAC)作用下早期即可發(fā)生裂解,從而釋放出血紅蛋白(hemoglobin)和鐵(iron)等游毒性代謝產(chǎn)物引起腦組織的損傷,米諾環(huán)素(minocycline)則與鐵螯合,從而阻斷鐵沉積所引起的組織損傷。血液中的血漿成分,尤其是凝血酶(thrombin)也可引起腦組織的損傷。SCH79797是蛋白酶活化受體-1(protease-activated receptor,PAR-1)的抑制剖,可以阻斷 thrombin 引起的損傷作用。然而這些血液成分在IVH后白質(zhì)損傷中的作用缺乏相關(guān)報道。隨著血液代謝成分在出血性腦卒中作用的認識不斷加深,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)了以不同血液成分為靶點的藥物。肝素(heparin)一方面可以與補體蛋白結(jié)合,抑制其活性,從而減少了紅細胞的裂解,另一方面可以與凝血酶結(jié)合并抑制其活性。然而,肝素能否有效的改善IVH后的白質(zhì)損傷仍有待于進一步研究。本研究將以IVH后白質(zhì)損傷為主要切入點,觀察大鼠實驗性IVH后白質(zhì)損傷標(biāo)記物的改變,探討血液成分在白質(zhì)損傷機制中的作用,并使用肝素、SCH79797、米諾環(huán)素進行不同靶點的干預(yù),觀察IVH后白質(zhì)損傷標(biāo)記物的變化,為臨床治療IVH提供可靠的干預(yù)靶點和思路。實驗方法第一部分1.采用側(cè)腦室注射自體血的方法建立大鼠腦室出血模型,成年雄性SD大鼠被隨機分為生理鹽水對照組(Saline組),自體血組(IVH組);分別將200μl生理鹽水、自體血通過腦立體定位儀緩慢注入大鼠右側(cè)側(cè)腦室,于24小時后行7.0TMRI掃描,掃描序列為T2,ImageJ測量白質(zhì)區(qū)域(胼胝體)T2高信號的體積。采用HE染色、組化、Western blot、RT-PCR方法檢測白質(zhì)損傷的標(biāo)記性蛋白MBP等關(guān)鍵蛋白、炎癥反應(yīng)和凋亡的改變情況。2.采用側(cè)腦室注射濃縮紅細胞和裂解紅細胞的方法建立大鼠腦室出血模型,成年雄性SD大鼠被隨機分為濃縮紅細胞組(Packed RBC組),裂解紅細胞組(IVH組);分別將50μl濃縮紅細胞組、裂解紅細胞通過腦立體定位儀緩慢注入大鼠右側(cè)側(cè)腦室,于24小時后行7.0T MRI掃描,掃描序列為T2,Image J測量白質(zhì)區(qū)域(胼胝體)T2高信號的體積。采用免疫組織化學(xué)方法檢測白質(zhì)損傷的標(biāo)記性蛋白MBP等改變。第二部分1.建立大鼠腦室內(nèi)鐵離子注射模型,觀察鐵離子注射后的白質(zhì)損傷情況:成年雄性SD大鼠被隨機分為生理鹽水對照組(Saline組),三氯化鐵(Iron組)和三氯化鐵+米諾環(huán)素組(Iron+minocycline),分別將上述200μl溶液注入大鼠右側(cè)側(cè)腦室內(nèi),三氯化鐵的濃度為0.5 mM,米諾環(huán)素的濃度為1.5 mM,于24小時后行7.0T MRI掃描,掃描序列為T2,Image J測量白質(zhì)區(qū)域(胼胝體)T2高信號的體積。采用免疫組織化學(xué)方法檢測白質(zhì)損傷的標(biāo)記性蛋白MBP、dMPB、β-APP的表達。2.建立大鼠腦室內(nèi)凝血酶注射模型,觀察凝血酶注射后的白質(zhì)損傷情況:成年雄性SD大鼠被隨機分為生理鹽水對照組(Saline組),凝血酶(Thrombin組)和凝血酶+SCH79797組(Thrombin+SCH79797),分別將50μl溶液注入大鼠右側(cè)側(cè)腦室內(nèi),凝血酶為3 units,SCH79797的濃度為0.15 nM。于24小時后行7.0TMRI掃描,掃描序列為T2,ImageJ測量白質(zhì)區(qū)域(胼胝體)T2高信號的體積。采用免疫組織化學(xué)方法檢測白質(zhì)損傷的標(biāo)記性蛋白MBP、dMPB、β-APP的表達。第三部分1.采用側(cè)腦室注射自體血的方法建立大鼠腦室出血模型,成年雄性SD大鼠被隨機分為生理鹽水(Saline組),自體血組(IVH組)和自體抗凝血組(heparinied blood);分別將200μl生理鹽水、自體血和自體抗凝血組通過腦立體定位儀緩慢注入大鼠右側(cè)側(cè)腦室,于24小時后行7.0T MRI掃描,掃描序列為T2,Image J測量白質(zhì)區(qū)域(胼胝體)T2高信號的體積。采用Western blot方法和TUNAL染色分別檢測白質(zhì)損傷的標(biāo)記性蛋白MBP、dMPB、β-APP的表達和白質(zhì)束內(nèi)凋亡細胞的情況。結(jié)果第一部分1.側(cè)腦室自體血注入法成功建立大鼠實驗性IVH模型,IVH大鼠白質(zhì)束內(nèi)有大量紅細胞聚集,白質(zhì)束發(fā)生斷裂,結(jié)構(gòu)排列紊亂,血腦屏障發(fā)生破壞;自體血注入后24小時白質(zhì)區(qū)域T2高信號的體積明顯增加;IVH后白質(zhì)束內(nèi)白質(zhì)損傷的標(biāo)記物如髓鞘基礎(chǔ)蛋白MBP表達降低,損傷的髓鞘基礎(chǔ)蛋白dMBP和軸突損傷的標(biāo)記性蛋白β-APP表達增加;白質(zhì)束內(nèi)出現(xiàn)NLRP3炎癥小體活化和炎癥因子表達的增加;白質(zhì)束內(nèi)凋亡的成熟少突膠質(zhì)細胞的數(shù)目增加,這些結(jié)果提示IVH后24小時即出現(xiàn)了白質(zhì)損傷,炎癥反應(yīng)和成熟少突膠質(zhì)細胞的凋亡參與了這一過程。2.側(cè)腦室注入裂解紅細胞后白質(zhì)區(qū)域T2高信號的體積明顯增加;白質(zhì)損傷髓鞘基礎(chǔ)蛋白MBP表達降低,損傷的髓鞘基礎(chǔ)蛋白dMBP和軸突損傷的標(biāo)記性蛋白β-APP表達增加;這些結(jié)果提示裂解紅細胞注入側(cè)腦室可引起白質(zhì)損傷。第二部分1.側(cè)腦室內(nèi)注射鐵可導(dǎo)致嚴重的白質(zhì)損傷,具體的表現(xiàn)有白質(zhì)束內(nèi)T2高信號的體積增加,MBP陽性染色面積減少,dMBP和β-APP的染色分級增加,鐵的螯合劑米諾環(huán)素可明顯減少側(cè)腦室鐵注射所引起的白質(zhì)損傷。2.側(cè)腦室內(nèi)注射凝血酶可導(dǎo)致嚴重的白質(zhì)損傷,具體的表現(xiàn)有白質(zhì)束內(nèi)T2高信號的體積增加,MBPP陽性染色面積減少,dMBP和β-APP的染色分級增加,PAR-1抑制劑SCH79797可明顯減少側(cè)腦室凝血酶注射所引起的白質(zhì)損傷。第三部分1.肝素可以減輕腦出血后的白質(zhì)損傷,主要的表現(xiàn)有白質(zhì)束內(nèi)T2高信號的體積減少,MBP蛋白的增加和dMBP和β-APP的表達的下降,同時肝素還可以減少白質(zhì)束內(nèi)細胞的凋亡。結(jié)論第一部分IVH發(fā)生后的急性期即存在著嚴重的白質(zhì)損傷,NLRP3炎癥小體活化所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和少突膠質(zhì)細胞的凋亡參與了這一病理生理過程。而且在急性期白質(zhì)損傷的發(fā)生過程中,紅細胞尤其是裂解的紅細胞發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。第二部分鐵離子和凝血酶腦室內(nèi)注射后均可引起明顯的白質(zhì)損傷,而且鐵螯合劑米諾環(huán)素和PAR-1的抑制劑SCH79797可減輕鐵和凝血酶所引起的白質(zhì)損傷,提示著鐵和凝血酶在腦室出血后急性白質(zhì)損傷中發(fā)揮著重要的作用。第三部分肝素可以有效地減輕大鼠腦室出血后的白質(zhì)損傷,肝素有可能成為腦室出血患者臨床治療新的選擇。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R743.34
【圖文】：

圖１－１邋ＩＶＨ后Ｔ２邋ＷＩ改變和ＨＥ染色

Ｉ嚴：灄１逡逑ＩＶ邋Ｈ邋．邐＊邐？邋，；邐．邋？邐：．邐－邐－邋／邋－逡逑圖１－１邋ＩＶＨ后Ｔ２邋ＷＩ改變和ＨＥ染色。我們可以觀察到ＩＶＨ大鼠白質(zhì)束出現(xiàn)明逡逑顯的高信號改變。ＨＥ染色可見白質(zhì)束內(nèi)大量的紅細胞聚集，白質(zhì)束存在廣泛的逡逑斷裂，腫脹和結(jié)構(gòu)排列的紊亂。Ｓｃａｌｅｂａｒ＝２００ｎｍ（４．０Ｘ）／２０｜ａｍ（４０Ｘ）。逡逑２７逡逑

邐Ｉ邐Ｉ逡逑圖１－２相對于Ｓａｌｉｎｅ組而言，我們可以觀察到ＩＶＨ大鼠白質(zhì)束Ｔ２高信號的體積逡逑明顯增加。＊＊ｐ＜０．０１邋ｖｓ邋Ｓａｌｉｎｅ，邋ｎ＝６。逡逑２８逡逑

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本文編號：2796309