發(fā)布時(shí)間：2020-08-17 19:42

【摘要】：第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定目的:體外對(duì)大鼠來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)和鑒定,為骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的安全應(yīng)用做好前期研究準(zhǔn)備。方法:1.通過(guò)差速貼壁法對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)鋪滿瓶底約80%時(shí),按照2:1比例進(jìn)行傳代,保存P3-P4代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定:采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P3代細(xì)胞表面間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物(CD34、CD90、CD45、CD71)及免疫熒光檢測(cè)P3代細(xì)胞表面間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物(CD34、CD90、CD105)表達(dá)情況。茜素紅染色鑒定成骨分化潛能,油紅O鑒定成脂分化潛能。結(jié)果:1.倒置顯微鏡下形態(tài):細(xì)胞生長(zhǎng)均勻,形態(tài)呈紡錘體樣,連續(xù)傳代無(wú)明顯形態(tài)變化、細(xì)胞自身無(wú)衰老趨勢(shì)。2.間接免疫熒光結(jié)果顯示,原代細(xì)胞表達(dá)CD90和CD105,不表達(dá)CD34。流式檢測(cè)結(jié)果顯示,細(xì)胞表面抗原CD71、CD90、CD34、CD45表達(dá)率分別是94.0%、100.0%、7.2%、4.7%,達(dá)到MSCs細(xì)胞表面抗原要求,可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。成骨、成脂誘導(dǎo)分別能觀察到鐵銹紅色結(jié)節(jié)和紅染脂滴。結(jié)論:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能通過(guò)差速貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行分離、可培養(yǎng)出純度高且具有多向分化潛能的細(xì)胞。第二部分腫瘤微環(huán)境中IL-22通過(guò)IL22RA1/STAT3通路促進(jìn)MSCs惡性轉(zhuǎn)變目的:探索C6膠質(zhì)瘤微環(huán)境中IL-22通過(guò)IL22RA1/STAT3通路誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用機(jī)制。方法:1.通過(guò)transwell小室,對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行間接共培養(yǎng),構(gòu)建體外C6膠質(zhì)瘤微環(huán)境。2.以正常大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為對(duì)照,檢測(cè)與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞間接共培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期、增殖、侵襲及遷移能力的變化;使用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液中IL-22的表達(dá);實(shí)驗(yàn)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)瘤化后大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞IL22RA1的表達(dá);同時(shí)采用生物信息學(xué)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤及正常細(xì)胞中IL-22及IL22RA1的表達(dá)情況。3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中添加外源性IL-22(20ng/ml),培養(yǎng)24和48小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的變化;同時(shí)檢測(cè)此時(shí)MSCs中STAT3及p-STAT3變化;4.轉(zhuǎn)染si-STAT3抑制STAT3表達(dá),觀察經(jīng)IL-22誘導(dǎo)后MSCs的細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的變化。結(jié)果:1.與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞間接共培養(yǎng)1個(gè)月后的MSCs,形態(tài)發(fā)生顯著變化,呈現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞樣改變,胞質(zhì)向核收縮,變細(xì)變長(zhǎng),胞核變小,細(xì)胞排列緊密,核質(zhì)比增大。2.與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后MSCs增殖能力顯著增高,且G2/S期比例較單獨(dú)MSCs培養(yǎng)組顯著增高;同時(shí)與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后的MSCs侵襲和遷移能力均顯著增加,提示與C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞共培養(yǎng)后MSCs具有惡性轉(zhuǎn)變的傾向。3.利用UCSC分析了IL-22和IL22RA1在TCGA-GBM中的表達(dá)譜癌癥基因組瀏覽器,發(fā)現(xiàn)原發(fā)性和復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的IL22RA1表達(dá)較正常組織增加,而IL-22在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和正常組織中的表達(dá)較低。4.ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞上清液中均無(wú)IL-22表達(dá);與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后的MSCs中IL22RA1的m RNA及蛋白表達(dá)均顯著增加。5.在IL-22作用第24h和48h后,MSCs細(xì)胞活力較MSCs單獨(dú)培養(yǎng)組均顯著增高;Bcl-xl表達(dá)均顯著增高;MSCs侵襲和遷移能力均顯著增加。6.IL-22能夠顯著增加STAT3和p-STAT3的表達(dá)水平,同時(shí)上調(diào)磷酸化和非磷酸化蛋白的比例;干擾STAT3后可顯著降低經(jīng)IL-22處理后的MSCs的增殖、侵襲及遷移能力。結(jié)論:C6膠質(zhì)瘤微環(huán)境中除腫瘤細(xì)胞本身通過(guò)旁分泌功能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變,腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞也可通過(guò)分泌IL-22等炎癥因子通過(guò)STAT3通路誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變。第三部分腫瘤微環(huán)境中Lnc RNA MEG3通過(guò)STAT3通路抑制MSCs惡性轉(zhuǎn)變目的:探索上調(diào)lnc RNA MEG通過(guò)STAT3/m TOR通路抑制C6膠質(zhì)瘤微環(huán)境中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的機(jī)制。方法:1.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)前后大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中l(wèi)nc RNA MEG3、lnc RNA H19、lnc RNA TUG1、lnc RNA PVT1、lnc RNA XIST、lnc RNA HOTAIRM1的表達(dá)變化。2.利用生物信息學(xué)對(duì)lnc RNA MEG3在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的表達(dá)進(jìn)行分析。3.通過(guò)體內(nèi)外分別檢測(cè)MEG3對(duì)瘤化后大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響:體外實(shí)驗(yàn):采用細(xì)胞周期檢測(cè)MEG3對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MEG3對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;采用Transwel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MEG對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立裸鼠皮下成瘤生長(zhǎng)模型,觀察MEG3對(duì)瘤化后大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)成瘤的影響。4.MEG3通過(guò)調(diào)控STAT3活性對(duì)抑制MSCs瘤化的機(jī)制研究:通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染lnc RNA MEG3后瘤化后的MSCs中STAT3的表達(dá)情況,通過(guò)Western blot及免疫熒光檢測(cè)STAT3及p-STAT3水平;結(jié)果:1.Realtime PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后的MSCs中l(wèi)nc RNA MEG3表達(dá)顯著降低;利用SAGE及Oncomine分析了lnc RNAs在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中l(wèi)nc RNA MEG3表達(dá)較正常組織均顯著降低,其中在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中表達(dá)降低尤為顯著。2.瘤化后大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MEG3慢病毒組,凋亡細(xì)胞數(shù)和壞死細(xì)胞數(shù)呈上升趨勢(shì),增殖、侵襲及遷移能力均顯著減低,過(guò)表達(dá)MEG3的MSCs在裸鼠皮下沒(méi)有形成腫瘤的重量和體積明顯減小及預(yù)后得到明顯改善。3.轉(zhuǎn)染MEG3慢病毒組,瘤化后的MSCs中STAT3 m RNA及蛋白表達(dá)均顯著降低。結(jié)論:腫瘤微環(huán)境中MSCs發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變與lnc RNA MEG3表達(dá)降低有關(guān);MEG3能夠通過(guò)抑制STAT3通路抑制腫瘤微環(huán)境中大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變。第四部分腫瘤微環(huán)境中STAT3通過(guò)m TOR通路抑制細(xì)胞自噬介導(dǎo)MSCs惡性轉(zhuǎn)變目的:探索腫瘤微環(huán)境中活化后是STAT3是否通過(guò)m TOR通路抑制大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自噬介導(dǎo)其發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變。方法:1.通過(guò)Western blot及免疫熒光觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞瘤化前后自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin1、P62及m TOR的表達(dá)變化;通過(guò)電鏡觀察瘤化前后MSCs中自噬小體數(shù)量的變化,綜合判斷大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞瘤化前后自噬性況的變化。2.通過(guò)si-STAT3干預(yù)STAT3表達(dá),采用Western blot及免疫熒光觀察自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin1、P62及m TOR的表達(dá)變化;采用LC3雙標(biāo)腺病毒,用激光共聚觀察干序STAT3表達(dá)后,瘤化后MSCs中自噬瘤的變化性況。3.通過(guò)m TOR抑制劑雷帕酶素,判斷通過(guò)抑制m TOR途徑恢復(fù)細(xì)胞自噬后,觀察其對(duì)瘤化后MSCs增殖、侵襲、遷移及皮下成瘤的影響。結(jié)果:1.通過(guò)Western blot及免疫熒光法檢測(cè)Beclin1、LC3B、P62及m TOR的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與C6膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)后的MSCs的LC3B-Ⅱ顯著降低,瘤化后的MSCs自噬水平在顯著降低。同時(shí)對(duì)Beclin1這一形成自噬體過(guò)程的重要蛋白做了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)瘤化后的MSCs中Beclin1表達(dá)顯著降低。與此同時(shí)自噬底物蛋白P62在瘤化后的MSCs中表達(dá)顯著增高,同時(shí)自噬抑制蛋白m TOR表達(dá)也顯著增高,進(jìn)一步證實(shí)瘤化后的MSCs自噬水平顯著降低。2.經(jīng)電鏡觀察干細(xì)胞瘤化后,細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量顯著減少。3.接受si-STAT3轉(zhuǎn)染后的瘤化了的MSCs可促進(jìn)由瘤化所導(dǎo)致的LC3表達(dá)抑制。與此同時(shí),轉(zhuǎn)si-STAT3后,瘤化后MSCs中m TOR及P62蛋白表達(dá)顯著降低,而B(niǎo)eclin1表達(dá)顯著增高;干擾STAT3后,細(xì)胞自噬體和自噬溶酶體均顯著增高,表明干擾STAT3后,瘤化后的MSCs自噬水平得到恢復(fù)。4.通過(guò)加入m TOR抑制劑雷帕霉素后,細(xì)胞增殖、侵襲及及遷移能力均顯著降低。結(jié)論:腫瘤微環(huán)境中活化后的STAT3主通過(guò)m TOR通路抑制大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自噬介導(dǎo)其發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.4
【圖文】：

2）誘導(dǎo) MSCs 向成脂細(xì)胞分化潛能：以 3×104的密度接種第三代大干細(xì)胞于 24 孔板內(nèi)；于接種第 1 天后添加成脂細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基（5換液一次并觀察脂滴形成情況；待脂滴形成，多聚甲醛固定；加油察脂滴紅染情況。驗(yàn)結(jié)果SCs 形態(tài)學(xué)代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)約 4-6 小時(shí)后，開(kāi)始進(jìn)行貼壁生長(zhǎng)，約 60% 原代細(xì)胞貼壁，培養(yǎng) 3 天后 MSCs 形態(tài)比較均一，細(xì)胞呈，似成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，均勻分布，排列有序，具有漩渦排列，隨代培養(yǎng)，經(jīng)連續(xù) 5 次傳代后，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)無(wú)異常改象

干細(xì)胞標(biāo)志物檢測(cè)（A）MSCs 免疫熒光染色結(jié)果（B）MSCs 流式細(xì)胞e1-2 Stem cell markers detection (A) The immunofluorescent staining of MScytometric analysis of MSCs MSCs 多向分化潛能誘導(dǎo)：加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基第 10 天后，可觀察到白色鈣結(jié)節(jié)懸逐日增多，在加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基 20 天后，通過(guò)對(duì)白色鈣結(jié)節(jié)可發(fā)現(xiàn)其呈鐵銹色；成脂誘導(dǎo)：在成脂誘導(dǎo)第 5 天后，于細(xì)胞滴，并逐日增多，在加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基 15 天后，通過(guò)對(duì)脂滴色，可發(fā)現(xiàn)其呈紅色。

圖 1-3 MSCs 成脂成骨分化潛能Figure1-3 Osteoblastic and lipogenic differentiation potential of MSC干細(xì)胞（MSCs），又稱多能干細(xì)胞，最初從骨髓中分離出干細(xì)胞（BMSCs）[5]。許多研究人員認(rèn)為，.MSCs 具有自，特異性歸巢到腫瘤和低免疫原性的能力。 近年來(lái)，MS治療。報(bào)道指出，MSCs 可抑制胰腺癌，卡波西氏肉瘤和乳獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，MSCs 可以促進(jìn)乳腺癌和結(jié)腸癌的進(jìn)展。因此，用是有爭(zhēng)議的[7]。MSCs 的表面抗原表達(dá)具有多樣性，表達(dá)包括 CD71、CD，且不表達(dá)包括 CD19、CD45、CD34 在內(nèi)的造血干細(xì)胞表疫熒光結(jié)果顯示，原代細(xì)胞表達(dá) CD90 和 CD105，不表達(dá)

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本文編號(hào)：2795753