【摘要】：第一部分大鼠骨髓間充質干細胞分離、培養(yǎng)、鑒定目的:體外對大鼠來源的骨髓間充質干細胞進行分離、培養(yǎng)和鑒定,為骨髓來源的間充質干細胞在腫瘤微環(huán)境中的安全應用做好前期研究準備。方法:1.通過差速貼壁法對大鼠骨髓間充質干細胞進行分離培養(yǎng)。觀察細胞生長情況,細胞貼壁生長鋪滿瓶底約80%時,按照2:1比例進行傳代,保存P3-P4代細胞用于后續(xù)實驗。2.大鼠骨髓間充質干細胞的鑒定:采用流式細胞術檢測P3代細胞表面間充質干細胞標記物(CD34、CD90、CD45、CD71)及免疫熒光檢測P3代細胞表面間充質干細胞標記物(CD34、CD90、CD105)表達情況。茜素紅染色鑒定成骨分化潛能,油紅O鑒定成脂分化潛能。結果:1.倒置顯微鏡下形態(tài):細胞生長均勻,形態(tài)呈紡錘體樣,連續(xù)傳代無明顯形態(tài)變化、細胞自身無衰老趨勢。2.間接免疫熒光結果顯示,原代細胞表達CD90和CD105,不表達CD34。流式檢測結果顯示,細胞表面抗原CD71、CD90、CD34、CD45表達率分別是94.0%、100.0%、7.2%、4.7%,達到MSCs細胞表面抗原要求,可以進行后續(xù)實驗。成骨、成脂誘導分別能觀察到鐵銹紅色結節(jié)和紅染脂滴。結論:大鼠骨髓間充質干細胞能通過差速貼壁培養(yǎng)法進行分離、可培養(yǎng)出純度高且具有多向分化潛能的細胞。第二部分腫瘤微環(huán)境中IL-22通過IL22RA1/STAT3通路促進MSCs惡性轉變目的:探索C6膠質瘤微環(huán)境中IL-22通過IL22RA1/STAT3通路誘導大鼠骨髓間充質干細胞惡性轉化過程中的作用機制。方法:1.通過transwell小室,對C6膠質瘤細胞與大鼠骨髓間充質干細胞進行間接共培養(yǎng),構建體外C6膠質瘤微環(huán)境。2.以正常大鼠骨髓間充質干細胞為對照,檢測與C6膠質瘤細胞間接共培養(yǎng)后細胞形態(tài)、細胞周期、增殖、侵襲及遷移能力的變化;使用ELISA檢測培養(yǎng)上清液中IL-22的表達;實驗熒光定量PCR及Western blot檢測瘤化后大鼠骨髓間充質干細胞IL22RA1的表達;同時采用生物信息學對神經膠質瘤及正常細胞中IL-22及IL22RA1的表達情況。3.骨髓間充質干細胞培養(yǎng)液中添加外源性IL-22(20ng/ml),培養(yǎng)24和48小時后檢測細胞增殖、侵襲及遷移能力的變化;同時檢測此時MSCs中STAT3及p-STAT3變化;4.轉染si-STAT3抑制STAT3表達,觀察經IL-22誘導后MSCs的細胞增殖、侵襲及遷移能力的變化。結果:1.與C6膠質瘤細胞間接共培養(yǎng)1個月后的MSCs,形態(tài)發(fā)生顯著變化,呈現(xiàn)神經膠質瘤細胞樣改變,胞質向核收縮,變細變長,胞核變小,細胞排列緊密,核質比增大。2.與C6膠質瘤細胞共培養(yǎng)后MSCs增殖能力顯著增高,且G2/S期比例較單獨MSCs培養(yǎng)組顯著增高;同時與C6膠質瘤細胞共培養(yǎng)后的MSCs侵襲和遷移能力均顯著增加,提示與C6膠質瘤干細胞共培養(yǎng)后MSCs具有惡性轉變的傾向。3.利用UCSC分析了IL-22和IL22RA1在TCGA-GBM中的表達譜癌癥基因組瀏覽器,發(fā)現(xiàn)原發(fā)性和復發(fā)性膠質母細胞瘤的IL22RA1表達較正常組織增加,而IL-22在膠質母細胞瘤和正常組織中的表達較低。4.ELISA檢測發(fā)現(xiàn)C6膠質瘤細胞及間充質干細胞上清液中均無IL-22表達;與C6膠質瘤細胞共培養(yǎng)后的MSCs中IL22RA1的m RNA及蛋白表達均顯著增加。5.在IL-22作用第24h和48h后,MSCs細胞活力較MSCs單獨培養(yǎng)組均顯著增高;Bcl-xl表達均顯著增高;MSCs侵襲和遷移能力均顯著增加。6.IL-22能夠顯著增加STAT3和p-STAT3的表達水平,同時上調磷酸化和非磷酸化蛋白的比例;干擾STAT3后可顯著降低經IL-22處理后的MSCs的增殖、侵襲及遷移能力。結論:C6膠質瘤微環(huán)境中除腫瘤細胞本身通過旁分泌功能誘導骨髓間充質干細胞惡性轉變,腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞也可通過分泌IL-22等炎癥因子通過STAT3通路誘導骨髓間充質干細胞惡性轉變。第三部分腫瘤微環(huán)境中Lnc RNA MEG3通過STAT3通路抑制MSCs惡性轉變目的:探索上調lnc RNA MEG通過STAT3/m TOR通路抑制C6膠質瘤微環(huán)境中骨髓間充質干細胞惡性轉變的機制。方法:1.采用實時熒光定量PCR檢測與C6膠質瘤細胞共培養(yǎng)前后大鼠骨髓間充質干細胞中l(wèi)nc RNA MEG3、lnc RNA H19、lnc RNA TUG1、lnc RNA PVT1、lnc RNA XIST、lnc RNA HOTAIRM1的表達變化。2.利用生物信息學對lnc RNA MEG3在神經系統(tǒng)腫瘤中的表達進行分析。3.通過體內外分別檢測MEG3對瘤化后大鼠骨髓間充質干細胞生物學特性的影響:體外實驗:采用細胞周期檢測MEG3對細胞增殖能力的影響;采用流式細胞術檢測MEG3對細胞凋亡的影響;采用Transwel實驗檢測MEG對細胞侵襲和遷移能力的影響。體內實驗:建立裸鼠皮下成瘤生長模型,觀察MEG3對瘤化后大鼠骨髓間充質干細胞體內成瘤的影響。4.MEG3通過調控STAT3活性對抑制MSCs瘤化的機制研究:通過熒光定量PCR檢測轉染lnc RNA MEG3后瘤化后的MSCs中STAT3的表達情況,通過Western blot及免疫熒光檢測STAT3及p-STAT3水平;結果:1.Realtime PCR檢測發(fā)現(xiàn)與C6膠質瘤細胞共培養(yǎng)后的MSCs中l(wèi)nc RNA MEG3表達顯著降低;利用SAGE及Oncomine分析了lnc RNAs在神經系統(tǒng)腫瘤中的表達,發(fā)現(xiàn)在神經系統(tǒng)腫瘤中l(wèi)nc RNA MEG3表達較正常組織均顯著降低,其中在神經膠質細胞瘤中表達降低尤為顯著。2.瘤化后大鼠骨髓間充質干細胞中轉染MEG3慢病毒組,凋亡細胞數(shù)和壞死細胞數(shù)呈上升趨勢,增殖、侵襲及遷移能力均顯著減低,過表達MEG3的MSCs在裸鼠皮下沒有形成腫瘤的重量和體積明顯減小及預后得到明顯改善。3.轉染MEG3慢病毒組,瘤化后的MSCs中STAT3 m RNA及蛋白表達均顯著降低。結論:腫瘤微環(huán)境中MSCs發(fā)生惡性轉變與lnc RNA MEG3表達降低有關;MEG3能夠通過抑制STAT3通路抑制腫瘤微環(huán)境中大鼠骨髓間充質干細胞發(fā)生惡性轉變。第四部分腫瘤微環(huán)境中STAT3通過m TOR通路抑制細胞自噬介導MSCs惡性轉變目的:探索腫瘤微環(huán)境中活化后是STAT3是否通過m TOR通路抑制大鼠骨髓間充質干細胞自噬介導其發(fā)生惡性轉變。方法:1.通過Western blot及免疫熒光觀察大鼠骨髓間充質干細胞瘤化前后自噬相關蛋白LC3B、Beclin1、P62及m TOR的表達變化;通過電鏡觀察瘤化前后MSCs中自噬小體數(shù)量的變化,綜合判斷大鼠骨髓間充質干細胞瘤化前后自噬性況的變化。2.通過si-STAT3干預STAT3表達,采用Western blot及免疫熒光觀察自噬相關蛋白LC3B、Beclin1、P62及m TOR的表達變化;采用LC3雙標腺病毒,用激光共聚觀察干序STAT3表達后,瘤化后MSCs中自噬瘤的變化性況。3.通過m TOR抑制劑雷帕酶素,判斷通過抑制m TOR途徑恢復細胞自噬后,觀察其對瘤化后MSCs增殖、侵襲、遷移及皮下成瘤的影響。結果:1.通過Western blot及免疫熒光法檢測Beclin1、LC3B、P62及m TOR的表達,結果發(fā)現(xiàn)與C6膠質瘤共培養(yǎng)后的MSCs的LC3B-Ⅱ顯著降低,瘤化后的MSCs自噬水平在顯著降低。同時對Beclin1這一形成自噬體過程的重要蛋白做了檢測,發(fā)現(xiàn)瘤化后的MSCs中Beclin1表達顯著降低。與此同時自噬底物蛋白P62在瘤化后的MSCs中表達顯著增高,同時自噬抑制蛋白m TOR表達也顯著增高,進一步證實瘤化后的MSCs自噬水平顯著降低。2.經電鏡觀察干細胞瘤化后,細胞內自噬體的數(shù)量顯著減少。3.接受si-STAT3轉染后的瘤化了的MSCs可促進由瘤化所導致的LC3表達抑制。與此同時,轉si-STAT3后,瘤化后MSCs中m TOR及P62蛋白表達顯著降低,而Beclin1表達顯著增高;干擾STAT3后,細胞自噬體和自噬溶酶體均顯著增高,表明干擾STAT3后,瘤化后的MSCs自噬水平得到恢復。4.通過加入m TOR抑制劑雷帕霉素后,細胞增殖、侵襲及及遷移能力均顯著降低。結論:腫瘤微環(huán)境中活化后的STAT3主通過m TOR通路抑制大鼠骨髓間充質干細胞自噬介導其發(fā)生惡性轉變。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R739.4
【圖文】：

2）誘導 MSCs 向成脂細胞分化潛能：以 3×104的密度接種第三代大干細胞于 24 孔板內；于接種第 1 天后添加成脂細胞誘導培養(yǎng)基（5換液一次并觀察脂滴形成情況；待脂滴形成，多聚甲醛固定；加油察脂滴紅染情況。驗結果SCs 形態(tài)學代大鼠骨髓間充質干細胞培養(yǎng)約 4-6 小時后，開始進行貼壁生長，約 60% 原代細胞貼壁，培養(yǎng) 3 天后 MSCs 形態(tài)比較均一，細胞呈，似成纖維細胞樣生長，均勻分布，排列有序，具有漩渦排列，隨代培養(yǎng)，經連續(xù) 5 次傳代后，大鼠骨髓間充質干細胞形態(tài)無異常改象

干細胞標志物檢測（A）MSCs 免疫熒光染色結果（B）MSCs 流式細胞e1-2 Stem cell markers detection (A) The immunofluorescent staining of MScytometric analysis of MSCs MSCs 多向分化潛能誘導：加入成骨誘導培養(yǎng)基第 10 天后，可觀察到白色鈣結節(jié)懸逐日增多，在加入成骨誘導培養(yǎng)基 20 天后，通過對白色鈣結節(jié)可發(fā)現(xiàn)其呈鐵銹色；成脂誘導：在成脂誘導第 5 天后，于細胞滴，并逐日增多，在加入成脂誘導培養(yǎng)基 15 天后，通過對脂滴色，可發(fā)現(xiàn)其呈紅色。

圖 1-3 MSCs 成脂成骨分化潛能Figure1-3 Osteoblastic and lipogenic differentiation potential of MSC干細胞（MSCs），又稱多能干細胞，最初從骨髓中分離出干細胞（BMSCs）[5]。許多研究人員認為，.MSCs 具有自，特異性歸巢到腫瘤和低免疫原性的能力。 近年來，MS治療。報道指出，MSCs 可抑制胰腺癌，卡波西氏肉瘤和乳獻報導，MSCs 可以促進乳腺癌和結腸癌的進展。因此，用是有爭議的[7]。MSCs 的表面抗原表達具有多樣性，表達包括 CD71、CD，且不表達包括 CD19、CD45、CD34 在內的造血干細胞表疫熒光結果顯示，原代細胞表達 CD90 和 CD105，不表達

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1 新型;;化學所在腫瘤微環(huán)境分子影像納米探針方面取得重要進展[J];化工新型材料;2019年01期

2 肖乾坤;孫淼淼;;腫瘤微環(huán)境下中性粒細胞的研究進展[J];河南大學學報(醫(yī)學版);2019年01期

3 方雪妮;周天;李泉旺;胡凱文;;中藥對腫瘤微環(huán)境各組分的調節(jié)作用[J];中華中醫(yī)藥雜志;2018年02期

4 吳v

本文編號：2795753