【摘要】：目的:隨著人口老齡化的進程,腦小血管病成為神經(jīng)科的研究熱點,而腦白質疏松是腦小血管病中以影像學特征命名的一組臨床綜合征。雖然腦白質疏松患者早期是無癥狀的,而病變卻是非良性病變,與臨床的不良結局有關,如運動障礙,癡呆,抑郁,腦卒中及總體患病率和死亡率的增加。近幾十年來,學者們圍繞著腦白質疏松的發(fā)病機理展開了大量的研究,探討遺傳因素和腦血流動力學的改變等,但是仍然沒有定論。目前關于腦白質疏松基因多態(tài)性的諸多研究表明,遺傳因素對腦白質疏松的發(fā)生也是至關重要的。腎素血管緊張素系統(tǒng)可以調節(jié)血壓及血管的緊張性,對動脈粥樣硬化形成起非常重要的作用,因此引發(fā)學者們的關注。腎素血管緊張素系統(tǒng)包括血管緊張素轉換酶(ACE),血管緊張素原(AGT)及血管緊張素Ⅱ1型受體(AGTR1)。許多研究指出腎素血管緊張素系統(tǒng)的基因多態(tài)性與心腦血管疾病和高血壓病具有相關性,并且與腦白質病變緊密相關。另外,學者們經(jīng)過大量研究認為腦白質疏松是由于腦血管儲備功能受到損傷,顱內低灌注,進而出現(xiàn)一系列臨床表現(xiàn)。由于經(jīng)顱多普勒超聲檢查具有簡便快捷等優(yōu)點,許多學者借助經(jīng)顱多普勒超聲觀察大腦中動脈的血流速度、搏動指數(shù)等參數(shù)判斷腦白質疏松患者顱內大動脈的血流改變及動態(tài)演變。結果發(fā)現(xiàn)腦白質疏松患者的大腦中動脈血流速度下降,搏動指數(shù)增高。有學者們通過經(jīng)顱多普勒超聲觀察社區(qū)老年人的腦血流調節(jié)功能,并且探討腦血流調節(jié)功能與腎素血管緊張素系統(tǒng)基因多態(tài)性的關系。因此,為了探討腎素血管緊張素系統(tǒng)基因多態(tài)性與腦白質疏松的關系,本研究檢測腦白質疏松患者腎素血管緊張素系統(tǒng)ACE-rs4311、rs4362、rs4461142、rs8066114、rs4646994,AGT-rs699、rs4762,AGTR1-rs5182、rs5186這9個位點的單核苷酸多態(tài)性,為缺血性腦白質疏松在遺傳方面的發(fā)病機制研究提供更多的理論依據(jù)。另外,本課題在同一組研究對象中篩選受試者通過經(jīng)顱多普勒超聲儀做屏氣試驗,評估中國北方漢族癥狀性腦白質疏松患者的血流動力學改變,探討屏氣指數(shù)與腦白質疏松患者影像表現(xiàn)之間的關系。本研究詣在從血流動力學的角度與基因研究結果相結合,揭示腦白質疏松的發(fā)病機制。研究方法:本研究為橫斷面研究。選擇2016年11月-2017年10月期間,在中國北方城市沈陽市第五人民醫(yī)院神經(jīng)內科住院及門診就診的漢族患者414例,年齡為43-93歲,其中男性220名,女性194名。按照嚴格的入選及排除標準選擇患者,參照Fazekas分級標準依據(jù)頭磁共振T2 FLAIR的表現(xiàn)對病變部位和病變程度進行輕重程度判斷,將患者分為0級,I級,II級,III級,即0級為無腦白質疏松,I級為輕度腦白質疏松(腦白質點狀病變),II級為中度腦白質疏松(早期融合病變),III級為重度腦白質疏松(片狀融合病變)。然后按照既往已經(jīng)驗證的方法,參照Yadav,Traylor等團隊關于腦白質疏松基因研究的分組標準,將Fazekas II級與III級合并,等同于多發(fā)性腔隙性腦梗死合并融合性腦白質病變,作為缺血性腦白質疏松病例組,Fazekas 0級與I級合并等同于孤立性腔隙性腦梗死(顱內點狀病變),作為缺血性腦白質疏松對照組。同時盡量滿足不同組別患者具備相同的性別、年齡及各種腦血管病易患因素,以減少各種混雜因素的影響。對腎素血管緊張素系統(tǒng)ACE-rs4311、rs4362、rs4461142、rs8066114,AGT-rs699、rs4762,AGTR1-rs5182、rs5186這8個位點采用SNaPshot分型技術檢測單核苷酸多態(tài)性,對ACE-rs4646994位點采用PCR技術進行分型鑒定。然后采用SPSS 24.0(IBM公司)軟件及SHEsis在線分析軟件進行統(tǒng)計分析。對各位點進行哈迪-溫伯格平衡檢驗,統(tǒng)計分析各位點基因型及等位基因在病例組與對照組的頻率分布,進行連鎖不平衡分析及單倍型分析。應用Logistic逐步回歸分析評估各位點基因型和等位基因與腦白質疏松發(fā)病危險性的關系。然后,在同一組研究對象中篩選適合的患者應用經(jīng)顱多普勒超聲儀做常規(guī)檢查和屏氣試驗,觀察患者兩側大腦中動脈血流速度在屏氣30秒前后的變化,記錄平均血流速度,計算屏氣指數(shù)。觀察腦白質疏松患者的臨床表現(xiàn)與影像表現(xiàn)之間的關系,評估屏氣指數(shù)與頭磁共振輕重程度的關系。結果:1.腎素血管緊張素系統(tǒng)的9個位點中只有ACE-rs4461142基因型CC,CT及TT在病例組與對照組的P0.05(P=0.048),有統(tǒng)計學意義。而其他8個位點的基因型在病例組與對照組的P值均0.05,沒有統(tǒng)計學意義。另外,所有9個位點的等位基因在病例組與對照組的P值均0.05,沒有統(tǒng)計學意義。2.ACE-rs4362的TT基因型(OR=2.674,95%CI:1.267~5.649,P=0.010),在控制各種混雜因素后,對缺血性腦白質疏松的發(fā)病危險度是CC基因型的2.674倍;T等位基因(OR=1.228,95%CI:1.038~1.454,P=0.017)在控制各種混雜因素后,對缺血性腦白質疏松的發(fā)病危險度是C等位基因的1.228倍。3.ACE-rs4461142的T等位基因(OR=1.190,95%CI:1.008~1.404,P=0.039)在控制各種混雜因素后,對缺血性腦白質疏松的發(fā)病危險度是C等位基因的1.190倍。4.AGTR1-rs5182的T等位基因(OR=1.527,95%CI:1.049~2.217,P=0.027)在控制各種混雜因素后,對缺血性腦白質疏松的發(fā)病危險度是C等位基因的1.547倍。5.rs4311-rs4362為強連鎖不平衡(r~20.6);rs4311-rs4646994,rs4362-rs4646994,rs4362-rs4461142,rs4311-rs4461142及rs5182-rs5186為較強的連鎖不平衡(r~20.1);其他為較低的連鎖不平衡。6.rs5182-rs5186的3種單倍型T-A,C-A,C-C,病例組與對照組不具備統(tǒng)計學意義(P0.05)。7.腦白質疏松的影像嚴重程度與認知功能受損相關,腦白質疏松的影像表現(xiàn)越重,認知功能受損越明顯。8.隨著腦白質疏松的影像表現(xiàn)加重,屏氣指數(shù)下降。9.在控制了年齡、冠心病及腦卒中病史后,屏氣指數(shù)與腦白質疏松仍然具有相關性(P0.05),與腦白質疏松獨立相關。結論:1.ACE-rs4362的TT基因型和T等位基因可能增加中國北方漢族人群缺血性腦白質疏松的發(fā)病風險。2.ACE-rs4461142的T等位基因可能增加中國北方漢族人群缺血性腦白質疏松的發(fā)病風險。3.AGTR1-rs5182的T等位基因可能增加中國北方漢族人群缺血性腦白質疏松的發(fā)病風險。4.ACE rs4311-rs4362為強連鎖不平衡。5.屏氣指數(shù)下降可能與中國北方人群腦白質疏松獨立相關。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R742
【圖文】：

圖 2.1 SNaPshot 實驗原理圖解本試驗技術流程：ACE- rs4311、rs4362、rs4461142、rs8066114，AGT- rs699、rs4762，AGTR1-rs5182、rs5186：DNA 樣本的質量評估——PCR 引物設計——PCR 循環(huán)——PCR產 物 純 化 ——SNaPshot 多 重 單 堿 基 延 伸 反 應 —— 延 伸 產 物 的 純 化——ABI3730XL 測序——GeneMapper 4.1 分析ACE-rs4646994 位點：設計PCR 引物——PCR擴增——瓊脂糖凝膠電泳——測序驗證2.4.2 SNaPshot 技術實驗過程DNA樣本取1μl 1% 瓊脂糖電泳對其樣本進行質量檢查以及濃度估計，然后根據(jù)估計的濃度將樣本稀釋到工作濃度5-10ng/μl。然后進行多重PCR反應，PCR引物設計如表2.1所示：表 2.1 引物序列及 PCR 長度

延伸反應：延伸反應體系（10μl）包括5μl SNaPshot Multiplex Kit(ABI), 2μl 化后多重PCR產物，1μl 延伸引物混合物，2μl 超純水。延伸引物混合物中各延伸引物的濃度均為0.8。延伸反應程序：96℃變性1min，96℃變性10s，55℃退火5s，60℃延伸30s共28個循環(huán)；然后4℃保存。延伸產物的純化：在10μl 延伸產物中加入1U SAP酶，37 ℃溫浴1小時, 后75℃滅活15分鐘。2.4.3 ACE-rs4646994 位點的技術過程首先設計圖2.2中下劃線序列的PCR引物：rs4646994 F:5’CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT3’R:5’GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT3’

中國醫(yī)科大學博士學位論文號為 2-16 到 2-30 號標本。Lane17， DL2000 分子量 marker。第三排，每隔一列上樣跑膠 Lane1：2-31； Lane3：2-32； Lane5:2-33；Lane7：2-34；Lane9：2-35； Lane11：2-36， Lane13：2-37， Lane15：2-38。Lane 17： DL-2000 分子量marker。3.2.2 ACE- rs4646994 的凝膠電泳圖（圖 3.2）

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本文編號：2795342