【摘要】：我們的研究小組在前期實驗中,經大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)模型側腦室給β-羥丁酸,發(fā)現適當劑量的酮體主要成分之一β-羥丁酸可顯著減少MCAO模型鼠腦組織梗死灶范圍和改善神經功能障礙,對MCAO模型發(fā)揮腦保護作用。為進一步明確酮體在缺血缺氧環(huán)境下的腦保護作用及其機制,本研究設計旨在探討酮體主要成分乙酰乙酸和β-羥丁酸對體外原代培養(yǎng)的SD胎鼠大腦皮質神經元細胞氧化性損傷是否有保護作用及其可能的相關機制。以無血清無糖培養(yǎng)基和三氣培養(yǎng)箱(healforce)進行缺氧培養(yǎng)的方式建立胎鼠大腦皮質神經元細胞氧化性損傷的體外模型,并在此基礎上從細胞層面上研究不同濃度乙酰乙酸和β-羥丁酸經歷不同預處理時間對糖氧剝奪致原代培養(yǎng)大鼠腦皮質神經元細胞損傷的拮抗作用以及其量效、時效關系。本課題主要分為以下兩部分:第一部分乙酰乙酸、β-羥丁酸對胎鼠大腦皮質神經元活力的影響[目的]取SD胎鼠(孕期15-20d)大腦皮質組織進行原代神經元的分離、純化與培養(yǎng),鑒別神經元的純度,觀察乙酰乙酸、β-羥丁酸對原代培養(yǎng)SD胎鼠大腦皮質神經元細胞存活率的影響及其量效、時效關系。[方法]1、購買孕期15-20d SD孕鼠,取胎鼠大腦皮質組織進行原代神經元細胞培養(yǎng)。2、培養(yǎng)7天后海馬神經元細胞進行神經元細胞純度鑒別。3、原代培養(yǎng)7天的新生鼠海馬神經元細胞分成正常對照組(正常neuron cell組)和實驗組。實驗組分成Ⅰ組(乙酰乙酸組)、Ⅱ組(β-羥丁酸組),各大組中均含有 10 個濃度的小組(1mM,2mM,3mM,5mM,10mM,20mM,30mM,40mM,50mM,1OOmM),每個濃度小組設給藥后作用12h、24h、36h三個時間點,每組設5個平行樣。4、CCK8法測定細胞增殖和細胞毒性,間接反映細胞存活率。[結果]1.原代SD胎鼠大腦皮質神經元細胞培養(yǎng)第7天觀察神經元細胞生長良好,胞體較大,胞突主干和分枝明顯延長并增粗,其突起形成稠密的神經網絡。2.免疫細胞化學法NSE鑒定神經元的經典方法。由結果可見分散的皮質神經元,神經元是主體,可占95%以上。3.CCK8比色分析法檢測神經元的存活率,結果顯示:隨乙酰乙酸濃度在1～10mM范圍內遞增,其神經元細胞的存活率與正常對照組并無統(tǒng)計差異(P0.05);在20～100mM范圍內時,其神經元細胞的存活率較正常對照組顯著降低(P0.01),且在30～1OOmM范圍內遞增時,其神經元細胞的存活率呈現遞減趨勢(P0.05),同一濃度作用時間延長其神經元細胞的存活率無統(tǒng)計學差異(P0.05)。隨β-羥丁酸濃度在1～5mM范圍內遞增、作用時間在12～36h內遞增,其神經元細胞的存活率與正常對照組并無統(tǒng)計差異(P0.05);在10mM濃度作用12h～24h時,其神經元細胞的存活率較正常亦無統(tǒng)計差異(P0.05),但在作用延長至36h時,其神經元細胞的存活率較正常對照組顯著降低(P0.05);濃度在20～100mM范圍內時,其神經元細胞的存活率較正常對照組顯著降低(P0.01),且隨著濃度遞增其神經元細胞的存活率呈現遞減趨勢(P0.05),濃度在20～50mM范圍內時,同一濃度隨作用時間延長其神經元細胞的存活率呈現進行性降低趨勢(P0.05),在1OOmM濃度時,各時間點之間神經元細胞的存活率無統(tǒng)計差異(P0.05)。[結論]實驗結果發(fā)現,乙酰乙酸濃度≤1OmM對神經元細胞無細胞毒性,說明這個濃度區(qū)間的乙酰乙酸可以作為后續(xù)實驗安全劑量。β-羥丁酸濃度≤5mM對神經元細胞無細胞毒性;β-羥丁酸濃度為10mM且作用時間≤24h時,其對神經元細胞無細胞毒性,但當作用時間延長至36h時,其對神經元細胞有細胞毒性,說明≤1OmM濃度區(qū)間的β-羥丁酸可以作為后續(xù)實驗安全劑量,且作用時間以≤24h為宜。第二部分乙酰乙酸、β-羥丁酸對糖氧剝奪誘導胎鼠大腦皮質神經元損傷的保護作用及其分子機制研究[目的]觀察乙酰乙酸、β-羥丁酸對糖氧剝奪后胎鼠大腦皮質神經元細胞凋亡的影響及其機制研究。[方法]1、原代培養(yǎng)7天的SD胎鼠大腦皮質神經元細胞,分成兩大組,即正常培養(yǎng)組與糖氧剝奪培養(yǎng)組(糖氧剝奪系無血清無糖培養(yǎng)基接種細胞后,以三氣培養(yǎng)箱(healforce)進行缺氧培養(yǎng)。),每個大組分7個小組即對照組、高劑量乙酰乙酸組、中劑量乙酰乙酸組、低劑量乙酰乙酸組、高劑量β-羥丁酸組、中劑量β-羥丁酸組和低劑量β-羥丁酸組,共計14個組。在這14個組的基礎上,設1h、5h、24h三個時間點。其中乙酰乙酸組低、中、高劑量3個濃度分別為2mM組、5mM組及8mM組,β-羥丁酸組低、中、高劑量3個濃度分別為2mM組、5mM組及10mM組。分別在作用1h、5h和24h后取細胞進行檢測。2、采用CCK8法測定細胞增殖,間接反映細胞存活率。3、采用線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ(輔酶Q-細胞色素C還原酶)檢測作線粒體分析。4、采用NSE熒光染色觀察神經元細胞形態(tài)及計算細胞純度。5、采用Tunel染色觀察細胞凋亡情況。6、采用 Western Blot 法檢測凋亡蛋白 caspase3、bcl2、bax 與 Cytochrome C 蛋白(CytC)。[結果]1、CCK8檢測法測定細胞存活率正常培養(yǎng)大組僅大劑量乙酰乙酸組在24h時間點神經元細胞的存活率增高(P0.05),其余各組各劑量、各時間點神經元細胞的存活率均無統(tǒng)計差異(P0.05)。糖原剝奪組各時間點神經元細胞的存活率較正常培養(yǎng)組顯著降低(P0.05);在24h時間點,乙酸乙酸組與β-羥丁酸組中的中劑量組和高劑量組神經元細胞的存活率較糖原剝奪組顯著增加,有統(tǒng)計差異(P0.01),高劑量組增加更顯著(P0.01),但仍低于正常培養(yǎng)組(P0.05),而低劑量組神經元細胞存活率較糖原剝奪組無顯著差異(P0.05);在1h和5h時間點時,各組神經元細胞的存活率均無顯著差異(P0.05)。2、線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ活性(輔酶Q-細胞色素C還原酶)檢測線粒體分析結果顯示:正常培養(yǎng)大組中乙酰乙酸與β-羥丁酸低、中、高劑量組神經細胞線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ活性均無明顯差異(P0.05)。糖氧剝奪大組中各劑量組神經細胞線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ活性均較正常培養(yǎng)組(即Normal)明顯降低(P0.01),乙酰乙酸與β-羥丁酸中、高劑量組較糖氧剝奪組(即Control)顯著升高(P0.05),且中劑量組較高劑量組升高更明顯(P0.05),而低劑量組較糖氧剝奪組無明顯差異(P0.05)。3、NSE熒光染色觀察神經元細胞形態(tài)正常培養(yǎng)大組各組神經元細胞胞體呈圓形或三角形,胞膜和核膜完整,胞體和胞核著色均勻一致,軸突和突起伸展,細胞與細胞間形成稠密的細胞連接網。在糖氧剝奪培養(yǎng)組中可見神經元細胞胞體有所變小,變形,細胞膜和核膜完整,但胞體出現發(fā)泡現象,隨著發(fā)泡現象明顯,其神經突起出現縮短甚至消失,細胞出現變圓。乙酰乙酸組與β-羥丁酸組中的中劑量組和高劑量組中均可見神經元細胞胞體變形現象、胞體發(fā)泡現象有所減少,突起縮短、消退現象有所改善,且高劑量組尤為明顯,胞體發(fā)泡現象明顯減少,胞膜、核膜界限清晰,細胞突起伸展良好,可見細胞與細胞間的連接網。而低劑量組與糖氧剝奪培養(yǎng)組之間的細胞形態(tài)無明顯差異。4、Tunel染色觀察細胞凋亡情況對各組神經元細胞TUNEL指數進行了分析顯示:糖原剝奪大組中各小組神經元細胞TUNEL指數顯著增高(P0.05);乙酰乙酸組與β-羥丁酸組中的中劑量組和高劑量組神經元細胞TUNEL指數較糖原剝奪組顯著降低(P0.01),高劑量組降低更顯著(P0.01),但仍明顯高于正常培養(yǎng)組(P0.05),而乙酰乙酸組與β-羥丁酸組中的低劑量組神經元細胞TUNEL指數較糖原剝奪組無顯著差異(P0.05)。5、Western Blot 法檢測凋亡蛋白 caspase3、bcl2、bax 與 CytC 蛋白 Western Blot實驗結果可見,與正常培養(yǎng)組相比,糖氧剝奪組caspase3、bcl2、bax與CytC蛋白均呈高表達狀態(tài)(P0.01)。糖氧剝奪后,乙酰乙酸與β-羥丁酸中、高劑量組caspase3、bax與CytC蛋白表達均較糖氧剝奪組明顯減少(P0.05),且高劑量組減少更顯著(P0.05),但仍高于正常培養(yǎng)組(P0.05),而乙酰乙酸與β-羥丁酸中、高劑量組bcl2蛋白表達較糖氧剝奪組明顯增加(P0.05),且高劑量組增加更顯著(P0.05)。乙酰乙酸與β-羥丁酸低劑量組caspase3、bax、bc12與CytC蛋白表達均較糖氧剝奪組無明顯差異(P0.05)。[結論]在糖氧剝奪后,適當劑量的乙酰乙酸和β-羥丁酸可以減輕糖氧剝奪致體外培養(yǎng)的胎鼠大腦皮質神經元細胞的毒性作用,通過促進抗凋亡因子bcl-2蛋白表達、抑制促凋亡因子bax蛋白表達和增強線粒體呼吸功能等進而降低caspase3蛋白的表達,最終實現改善糖氧剝奪所致的神經元細胞的凋亡,促進神經元存活,發(fā)揮神經元細胞保護作用。
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R743
【圖文】：

１、況觀皮質神經元細胞接種２ｈ后，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，可見細胞貼壁逡逑生長，但大多數貼壁不牢固，大部分神經元呈小圓形，少數神經元細胞的胞體呈條逡逑索狀，細胞的兩端開始有短的突起出現。培養(yǎng)Ｉｄ后，神經細胞的突起開始逐漸延逡逑長，部分細胞出現聚集融合的現象。培養(yǎng)２ｄ后，神經元突起開始逐漸增多延長，逡逑并開始形成稀疏的神經網絡（見圖卜Ａ）。培養(yǎng)４￣５山神經元細胞胞體開始逐漸生逡逑長，突起延長并形成較致密的神經網絡（見圖１－Ｂ）。培養(yǎng)７ｄ，典型樣生長，胞體逡逑透亮變大，胞體兩側長軸突伸出，并形成了稠密的神經網絡結構（見圖卜Ｃ）。逡逑２、神經元細胞純度鑒定結果逡逑對分離培養(yǎng)純化的細胞行ＮＳＥ熒光染色，可見ＮＳＥ染色陽性的細胞（見圖１－Ｄ），逡逑ＤＡＰＩ顯示出所有細胞核的標記物（見圖１－Ｅ），兩圖重疊（ｍｅｒｇｅ）之后（見圖１－Ｆ），逡逑計算神經元所占的比例，其神經元細胞純度＞９５邋％。逡逑

低（Ｐ＜０．０１），且在３０？ｌＯＯｍＭ蒗圍內遞增時，其神經元細胞的存活率呈現遞減趨逡逑勢（Ｐ＜０．０５），同一濃度作用時間延長其神經元細胞存活率無統(tǒng)計學差異（Ｐ＞0．0５）逡逑（見圖２－Ａ）。當ｐ－羥丁酸濃度的在１？５ｍＭ范圍內遞增、作用T間在１２？３６ｈ內遞逡逑增，其神經元細胞的存活率與正常對照組并無統(tǒng)計差異（Ｐ＞0．0５）；在１０ｍＭ濃度逡逑作用１２ｈ？２４ｈ時，其神經元細胞的存活率較正常亦無統(tǒng)計差異（Ｐ＞０．０５），但在作逡逑用延長至３６ｈ時，其yL經元細胞的存活率較正常對照組顯著降低（Ｐ＜０．０５）；濃度逡逑在２０？ｌＯＯｍＭ范圍內時，其神經元細胞的存活率較正常對照組顯著降低（Ｐ＜０．０１邋），逡逑且隨著濃度遞增其神經元細胞的存活率呈現遞減趨勢（Ｐ＜0．0５），濃度在２０？５０ｍＭ逡逑范圍內時，同一濃度隨作用T間延長其神經元細胞的存活率呈現進行性降低趨勢逡逑（Ｐ＜０．０５），在ｌＯＯｍＭ濃度時，各時間點之間神經元細胞的存活率無統(tǒng)計差異逡逑（Ｐ＞０．０５）（見圖邋２－Ｂ）。逡逑Ｎｏｒｍａｌ逡逑Ｖ．邋＿邐Ｉ邐Ｉ邐■邐■邋ＡＣ邋５ｍ、ｌ逡逑Ｉ邋Ｓ邋６0＂邐Ｉ邋ｒ１！邐Ｉ邋ｎ．邐■邋ｈ邐ＡＣ邋１０ｍ、ｌ逡逑＂ｊ邐ＩＩＩ邋ｉｉ？邐ｌｌｌｌｉｉ邋ｉｌｉ＝ｌＥ逡逑＾邐＾Ｓ°邐ｍｍ邋ＡＣ邋ｌＯＯｍＭ逡逑ｌ＇ｉｍｅ（邋ｈｏｕｒｓ）逡逑？邋？邋？氣ｎ邋ｉｉＡ．邋＿ａ邐１邋１．邋．邋．邐■邋｜邐．．邋／＊／邋＊＊邋＇＊邋－邋Ｉ邐、0邋ｒ邋ｍ邋ａ邋Ｉ逡逑一…■邋Ｉ邋１邐二：一■？邋｜邋］邐’邋■邋Ｉ邋｜邐ＢＨＢ

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本文編號：2794962