【摘要】：我們的研究小組在前期實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型側(cè)腦室給β-羥丁酸,發(fā)現(xiàn)適當(dāng)劑量的酮體主要成分之一β-羥丁酸可顯著減少M(fèi)CAO模型鼠腦組織梗死灶范圍和改善神經(jīng)功能障礙,對(duì)MCAO模型發(fā)揮腦保護(hù)作用。為進(jìn)一步明確酮體在缺血缺氧環(huán)境下的腦保護(hù)作用及其機(jī)制,本研究設(shè)計(jì)旨在探討酮體主要成分乙酰乙酸和β-羥丁酸對(duì)體外原代培養(yǎng)的SD胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞氧化性損傷是否有保護(hù)作用及其可能的相關(guān)機(jī)制。以無血清無糖培養(yǎng)基和三氣培養(yǎng)箱(healforce)進(jìn)行缺氧培養(yǎng)的方式建立胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞氧化性損傷的體外模型,并在此基礎(chǔ)上從細(xì)胞層面上研究不同濃度乙酰乙酸和β-羥丁酸經(jīng)歷不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)糖氧剝奪致原代培養(yǎng)大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞損傷的拮抗作用以及其量效、時(shí)效關(guān)系。本課題主要分為以下兩部分:第一部分乙酰乙酸、β-羥丁酸對(duì)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元活力的影響[目的]取SD胎鼠(孕期15-20d)大腦皮質(zhì)組織進(jìn)行原代神經(jīng)元的分離、純化與培養(yǎng),鑒別神經(jīng)元的純度,觀察乙酰乙酸、β-羥丁酸對(duì)原代培養(yǎng)SD胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞存活率的影響及其量效、時(shí)效關(guān)系。[方法]1、購買孕期15-20d SD孕鼠,取胎鼠大腦皮質(zhì)組織進(jìn)行原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)。2、培養(yǎng)7天后海馬神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)元細(xì)胞純度鑒別。3、原代培養(yǎng)7天的新生鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞分成正常對(duì)照組(正常neuron cell組)和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分成Ⅰ組(乙酰乙酸組)、Ⅱ組(β-羥丁酸組),各大組中均含有 10 個(gè)濃度的小組(1mM,2mM,3mM,5mM,10mM,20mM,30mM,40mM,50mM,1OOmM),每個(gè)濃度小組設(shè)給藥后作用12h、24h、36h三個(gè)時(shí)間點(diǎn),每組設(shè)5個(gè)平行樣。4、CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性,間接反映細(xì)胞存活率。[結(jié)果]1.原代SD胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)第7天觀察神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)良好,胞體較大,胞突主干和分枝明顯延長(zhǎng)并增粗,其突起形成稠密的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。2.免疫細(xì)胞化學(xué)法NSE鑒定神經(jīng)元的經(jīng)典方法。由結(jié)果可見分散的皮質(zhì)神經(jīng)元,神經(jīng)元是主體,可占95%以上。3.CCK8比色分析法檢測(cè)神經(jīng)元的存活率,結(jié)果顯示:隨乙酰乙酸濃度在1～10mM范圍內(nèi)遞增,其神經(jīng)元細(xì)胞的存活率與正常對(duì)照組并無統(tǒng)計(jì)差異(P0.05);在20～100mM范圍內(nèi)時(shí),其神經(jīng)元細(xì)胞的存活率較正常對(duì)照組顯著降低(P0.01),且在30～1OOmM范圍內(nèi)遞增時(shí),其神經(jīng)元細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)(P0.05),同一濃度作用時(shí)間延長(zhǎng)其神經(jīng)元細(xì)胞的存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。隨β-羥丁酸濃度在1～5mM范圍內(nèi)遞增、作用時(shí)間在12～36h內(nèi)遞增,其神經(jīng)元細(xì)胞的存活率與正常對(duì)照組并無統(tǒng)計(jì)差異(P0.05);在10mM濃度作用12h～24h時(shí),其神經(jīng)元細(xì)胞的存活率較正常亦無統(tǒng)計(jì)差異(P0.05),但在作用延長(zhǎng)至36h時(shí),其神經(jīng)元細(xì)胞的存活率較正常對(duì)照組顯著降低(P0.05);濃度在20～100mM范圍內(nèi)時(shí),其神經(jīng)元細(xì)胞的存活率較正常對(duì)照組顯著降低(P0.01),且隨著濃度遞增其神經(jīng)元細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)(P0.05),濃度在20～50mM范圍內(nèi)時(shí),同一濃度隨作用時(shí)間延長(zhǎng)其神經(jīng)元細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)進(jìn)行性降低趨勢(shì)(P0.05),在1OOmM濃度時(shí),各時(shí)間點(diǎn)之間神經(jīng)元細(xì)胞的存活率無統(tǒng)計(jì)差異(P0.05)。[結(jié)論]實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),乙酰乙酸濃度≤1OmM對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞無細(xì)胞毒性,說明這個(gè)濃度區(qū)間的乙酰乙酸可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)安全劑量。β-羥丁酸濃度≤5mM對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞無細(xì)胞毒性;β-羥丁酸濃度為10mM且作用時(shí)間≤24h時(shí),其對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞無細(xì)胞毒性,但當(dāng)作用時(shí)間延長(zhǎng)至36h時(shí),其對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞有細(xì)胞毒性,說明≤1OmM濃度區(qū)間的β-羥丁酸可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)安全劑量,且作用時(shí)間以≤24h為宜。第二部分乙酰乙酸、β-羥丁酸對(duì)糖氧剝奪誘導(dǎo)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及其分子機(jī)制研究[目的]觀察乙酰乙酸、β-羥丁酸對(duì)糖氧剝奪后胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究。[方法]1、原代培養(yǎng)7天的SD胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞,分成兩大組,即正常培養(yǎng)組與糖氧剝奪培養(yǎng)組(糖氧剝奪系無血清無糖培養(yǎng)基接種細(xì)胞后,以三氣培養(yǎng)箱(healforce)進(jìn)行缺氧培養(yǎng)。),每個(gè)大組分7個(gè)小組即對(duì)照組、高劑量乙酰乙酸組、中劑量乙酰乙酸組、低劑量乙酰乙酸組、高劑量β-羥丁酸組、中劑量β-羥丁酸組和低劑量β-羥丁酸組,共計(jì)14個(gè)組。在這14個(gè)組的基礎(chǔ)上,設(shè)1h、5h、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。其中乙酰乙酸組低、中、高劑量3個(gè)濃度分別為2mM組、5mM組及8mM組,β-羥丁酸組低、中、高劑量3個(gè)濃度分別為2mM組、5mM組及10mM組。分別在作用1h、5h和24h后取細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。2、采用CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖,間接反映細(xì)胞存活率。3、采用線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ(輔酶Q-細(xì)胞色素C還原酶)檢測(cè)作線粒體分析。4、采用NSE熒光染色觀察神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)及計(jì)算細(xì)胞純度。5、采用Tunel染色觀察細(xì)胞凋亡情況。6、采用 Western Blot 法檢測(cè)凋亡蛋白 caspase3、bcl2、bax 與 Cytochrome C 蛋白(CytC)。[結(jié)果]1、CCK8檢測(cè)法測(cè)定細(xì)胞存活率正常培養(yǎng)大組僅大劑量乙酰乙酸組在24h時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元細(xì)胞的存活率增高(P0.05),其余各組各劑量、各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元細(xì)胞的存活率均無統(tǒng)計(jì)差異(P0.05)。糖原剝奪組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元細(xì)胞的存活率較正常培養(yǎng)組顯著降低(P0.05);在24h時(shí)間點(diǎn),乙酸乙酸組與β-羥丁酸組中的中劑量組和高劑量組神經(jīng)元細(xì)胞的存活率較糖原剝奪組顯著增加,有統(tǒng)計(jì)差異(P0.01),高劑量組增加更顯著(P0.01),但仍低于正常培養(yǎng)組(P0.05),而低劑量組神經(jīng)元細(xì)胞存活率較糖原剝奪組無顯著差異(P0.05);在1h和5h時(shí)間點(diǎn)時(shí),各組神經(jīng)元細(xì)胞的存活率均無顯著差異(P0.05)。2、線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ活性(輔酶Q-細(xì)胞色素C還原酶)檢測(cè)線粒體分析結(jié)果顯示:正常培養(yǎng)大組中乙酰乙酸與β-羥丁酸低、中、高劑量組神經(jīng)細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ活性均無明顯差異(P0.05)。糖氧剝奪大組中各劑量組神經(jīng)細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ活性均較正常培養(yǎng)組(即Normal)明顯降低(P0.01),乙酰乙酸與β-羥丁酸中、高劑量組較糖氧剝奪組(即Control)顯著升高(P0.05),且中劑量組較高劑量組升高更明顯(P0.05),而低劑量組較糖氧剝奪組無明顯差異(P0.05)。3、NSE熒光染色觀察神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常培養(yǎng)大組各組神經(jīng)元細(xì)胞胞體呈圓形或三角形,胞膜和核膜完整,胞體和胞核著色均勻一致,軸突和突起伸展,細(xì)胞與細(xì)胞間形成稠密的細(xì)胞連接網(wǎng)。在糖氧剝奪培養(yǎng)組中可見神經(jīng)元細(xì)胞胞體有所變小,變形,細(xì)胞膜和核膜完整,但胞體出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,隨著發(fā)泡現(xiàn)象明顯,其神經(jīng)突起出現(xiàn)縮短甚至消失,細(xì)胞出現(xiàn)變圓。乙酰乙酸組與β-羥丁酸組中的中劑量組和高劑量組中均可見神經(jīng)元細(xì)胞胞體變形現(xiàn)象、胞體發(fā)泡現(xiàn)象有所減少,突起縮短、消退現(xiàn)象有所改善,且高劑量組尤為明顯,胞體發(fā)泡現(xiàn)象明顯減少,胞膜、核膜界限清晰,細(xì)胞突起伸展良好,可見細(xì)胞與細(xì)胞間的連接網(wǎng)。而低劑量組與糖氧剝奪培養(yǎng)組之間的細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。4、Tunel染色觀察細(xì)胞凋亡情況對(duì)各組神經(jīng)元細(xì)胞TUNEL指數(shù)進(jìn)行了分析顯示:糖原剝奪大組中各小組神經(jīng)元細(xì)胞TUNEL指數(shù)顯著增高(P0.05);乙酰乙酸組與β-羥丁酸組中的中劑量組和高劑量組神經(jīng)元細(xì)胞TUNEL指數(shù)較糖原剝奪組顯著降低(P0.01),高劑量組降低更顯著(P0.01),但仍明顯高于正常培養(yǎng)組(P0.05),而乙酰乙酸組與β-羥丁酸組中的低劑量組神經(jīng)元細(xì)胞TUNEL指數(shù)較糖原剝奪組無顯著差異(P0.05)。5、Western Blot 法檢測(cè)凋亡蛋白 caspase3、bcl2、bax 與 CytC 蛋白 Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見,與正常培養(yǎng)組相比,糖氧剝奪組caspase3、bcl2、bax與CytC蛋白均呈高表達(dá)狀態(tài)(P0.01)。糖氧剝奪后,乙酰乙酸與β-羥丁酸中、高劑量組caspase3、bax與CytC蛋白表達(dá)均較糖氧剝奪組明顯減少(P0.05),且高劑量組減少更顯著(P0.05),但仍高于正常培養(yǎng)組(P0.05),而乙酰乙酸與β-羥丁酸中、高劑量組bcl2蛋白表達(dá)較糖氧剝奪組明顯增加(P0.05),且高劑量組增加更顯著(P0.05)。乙酰乙酸與β-羥丁酸低劑量組caspase3、bax、bc12與CytC蛋白表達(dá)均較糖氧剝奪組無明顯差異(P0.05)。[結(jié)論]在糖氧剝奪后,適當(dāng)劑量的乙酰乙酸和β-羥丁酸可以減輕糖氧剝奪致體外培養(yǎng)的胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的毒性作用,通過促進(jìn)抗凋亡因子bcl-2蛋白表達(dá)、抑制促凋亡因子bax蛋白表達(dá)和增強(qiáng)線粒體呼吸功能等進(jìn)而降低caspase3蛋白的表達(dá),最終實(shí)現(xiàn)改善糖氧剝奪所致的神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)神經(jīng)元存活,發(fā)揮神經(jīng)元細(xì)胞保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R743
【圖文】：

１、況觀皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞接種２ｈ后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，可見細(xì)胞貼壁逡逑生長(zhǎng)，但大多數(shù)貼壁不牢固，大部分神經(jīng)元呈小圓形，少數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞的胞體呈條逡逑索狀，細(xì)胞的兩端開始有短的突起出現(xiàn)。培養(yǎng)Ｉｄ后，神經(jīng)細(xì)胞的突起開始逐漸延逡逑長(zhǎng)，部分細(xì)胞出現(xiàn)聚集融合的現(xiàn)象。培養(yǎng)２ｄ后，神經(jīng)元突起開始逐漸增多延長(zhǎng)，逡逑并開始形成稀疏的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（見圖卜Ａ）。培養(yǎng)４￣５山神經(jīng)元細(xì)胞胞體開始逐漸生逡逑長(zhǎng)，突起延長(zhǎng)并形成較致密的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（見圖１－Ｂ）。培養(yǎng)７ｄ，典型樣生長(zhǎng)，胞體逡逑透亮變大，胞體兩側(cè)長(zhǎng)軸突伸出，并形成了稠密的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（見圖卜Ｃ）。逡逑２、神經(jīng)元細(xì)胞純度鑒定結(jié)果逡逑對(duì)分離培養(yǎng)純化的細(xì)胞行ＮＳＥ熒光染色，可見ＮＳＥ染色陽性的細(xì)胞（見圖１－Ｄ），逡逑ＤＡＰＩ顯示出所有細(xì)胞核的標(biāo)記物（見圖１－Ｅ），兩圖重疊（ｍｅｒｇｅ）之后（見圖１－Ｆ），逡逑計(jì)算神經(jīng)元所占的比例，其神經(jīng)元細(xì)胞純度＞９５邋％。逡逑

低（Ｐ＜０．０１），且在３０？ｌＯＯｍＭ蒗圍內(nèi)遞增時(shí)，其神經(jīng)元細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)遞減趨逡逑勢(shì)（Ｐ＜０．０５），同一濃度作用時(shí)間延長(zhǎng)其神經(jīng)元細(xì)胞存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ｐ＞0．0５）逡逑（見圖２－Ａ）。當(dāng)ｐ－羥丁酸濃度的在１？５ｍＭ范圍內(nèi)遞增、作用T間在１２？３６ｈ內(nèi)遞逡逑增，其神經(jīng)元細(xì)胞的存活率與正常對(duì)照組并無統(tǒng)計(jì)差異（Ｐ＞0．0５）；在１０ｍＭ濃度逡逑作用１２ｈ？２４ｈ時(shí)，其神經(jīng)元細(xì)胞的存活率較正常亦無統(tǒng)計(jì)差異（Ｐ＞０．０５），但在作逡逑用延長(zhǎng)至３６ｈ時(shí)，其yL經(jīng)元細(xì)胞的存活率較正常對(duì)照組顯著降低（Ｐ＜０．０５）；濃度逡逑在２０？ｌＯＯｍＭ范圍內(nèi)時(shí)，其神經(jīng)元細(xì)胞的存活率較正常對(duì)照組顯著降低（Ｐ＜０．０１邋），逡逑且隨著濃度遞增其神經(jīng)元細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)（Ｐ＜0．0５），濃度在２０？５０ｍＭ逡逑范圍內(nèi)時(shí)，同一濃度隨作用T間延長(zhǎng)其神經(jīng)元細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)進(jìn)行性降低趨勢(shì)逡逑（Ｐ＜０．０５），在ｌＯＯｍＭ濃度時(shí)，各時(shí)間點(diǎn)之間神經(jīng)元細(xì)胞的存活率無統(tǒng)計(jì)差異逡逑（Ｐ＞０．０５）（見圖邋２－Ｂ）。逡逑Ｎｏｒｍａｌ逡逑Ｖ．邋＿邐Ｉ邐Ｉ邐■邐■邋ＡＣ邋５ｍ、ｌ逡逑Ｉ邋Ｓ邋６0＂邐Ｉ邋ｒ１！邐Ｉ邋ｎ．邐■邋ｈ邐ＡＣ邋１０ｍ、ｌ逡逑＂ｊ邐ＩＩＩ邋ｉｉ？邐ｌｌｌｌｉｉ邋ｉｌｉ＝ｌＥ逡逑＾邐＾Ｓ°邐ｍｍ邋ＡＣ邋ｌＯＯｍＭ逡逑ｌ＇ｉｍｅ（邋ｈｏｕｒｓ）逡逑？邋？邋？氣ｎ邋ｉｉＡ．邋＿ａ邐１邋１．邋．邋．邐■邋｜邐．．邋／＊／邋＊＊邋＇＊邋－邋Ｉ邐、0邋ｒ邋ｍ邋ａ邋Ｉ逡逑一…■邋Ｉ邋１邐二：一■？邋｜邋］邐’邋■邋Ｉ邋｜邐ＢＨＢ

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本文編號(hào)：2794962