【摘要】：研究背景膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤,具有高侵襲、高復發(fā)和易產(chǎn)生耐藥性等特點。手術結(jié)合放療、化療的綜合治療模式是惡性膠質(zhì)瘤治療的主要方案,低級別膠質(zhì)瘤仍以手術治療為主�；熡绕鋵τ谥委熗砥谀z質(zhì)瘤以及減少復發(fā)具有重要意義,但是化療對于主要為實體瘤的膠質(zhì)瘤來說,療效仍無法令人滿意。因此,尋找特異性強、低毒高效的新型抗腫瘤藥物,是抗膠質(zhì)瘤研究領域的熱點。NF-κB在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的調(diào)控作用,研究證實,NF-κB在多種實體惡性腫瘤中表達水平均顯著增加,例如非小細胞肺癌、肝癌、胰腺癌以及膠質(zhì)瘤等,其作用與抑制癌細胞凋亡、促進侵襲轉(zhuǎn)移等方面密切相關。NF-κB及其信號通路的激活在多種腫瘤細胞中都處于持續(xù)性狀態(tài),包括造血系統(tǒng)腫瘤和實體腫瘤,被認為是多種惡性腫瘤發(fā)病的關鍵機制之一。膠質(zhì)瘤細胞中NF-κB通路的激活狀態(tài)并非一成不變,而是受到多種體內(nèi)和體外因素的共同作用。目前,針對NF-κB通路抑制劑的研發(fā)雖有成效但仍然需要進行更深層次的研究,仍需要繼續(xù)探索NF-κB通路抑制劑在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及相關治療的作用機制。本課題在前期高通量藥物篩選的基礎上,擬通過觀察NF-κB抑制劑對人腦膠質(zhì)瘤細胞株和人原代膠質(zhì)瘤細胞增殖、凋亡的作用,從細胞分子生物學水平揭示NF-κB抑制劑抑制膠質(zhì)瘤惡性生物學行為的作用及其機制。最后,將采用原位移植瘤動物模型檢驗NF-κB抑制劑的抗膠質(zhì)瘤作用,揭示NF-κB抑制劑在體內(nèi)對膠質(zhì)瘤的治療作用,從而為NF-κB抑制劑的臨床應用轉(zhuǎn)化提供實驗依據(jù)。研究內(nèi)容(1)采用了人膠質(zhì)瘤細胞系U87,通過Target Selective Inhibitor Library對464種化合物的抗膠質(zhì)瘤活性進行篩選,并對其抗膠質(zhì)瘤活性進行實驗鑒定;(2)采用NF-κB抑制劑CAPE、JSH-23、S4-A作為研究對象,采用人膠質(zhì)瘤細胞系U87,M059K和U251以及人原代膠質(zhì)瘤細胞作為研究模型;(3)采用CCK-8檢測NF-κB抑制劑對膠質(zhì)瘤細胞活力的影響,采用Brdu法檢測膠質(zhì)瘤細胞增殖能力,采用Hoechst33342染色試劑和TUNEL法檢測膠質(zhì)瘤細胞的凋亡水平;(4)采用Realtime PCR和Western blot檢測膠質(zhì)瘤細胞中目標基因的mRNA和蛋白表達水平;(5)采用ELISA法檢測NF-κB抑制劑對TNF-α因子濃度的影響,采用試劑盒檢測膠質(zhì)瘤細胞中Caspase-3/7活性;(6)采用裸鼠的腦膠質(zhì)瘤原位移植瘤模型探索在在體條件下NF-κB抑制劑CAPE對人膠質(zhì)瘤細胞U87增殖和凋亡的作用,以及對腫瘤體積、腫瘤細胞形態(tài)、裸鼠生存率的影響,同時檢測裸鼠膠質(zhì)瘤組織中TNF-α因子濃度、Caspase-3/7活性、p65 NF-κB的磷酸化水平。研究結(jié)果(1)經(jīng)過初步篩選,將Target Selective Inhibitor Library中的464種候選藥物作用于U87細胞后之間的差異通過細胞活力以不同的顏色在熱點圖(Hit map)里進行區(qū)分,根據(jù)熱點圖1所示,抑制U87細胞活力的前5種化學物質(zhì)為CAPE(細胞活力=0.161)、Cryptotanshinone(細胞活力=0.191)、PF-5274857(細胞活力=0.197)、Pifithrin-μ(細胞活力=0.201)和Tenovin-6(細胞活力=0.202)。CAPE是一種NF-κB抑制劑,另外兩種NF-κB抑制劑JSH-23(細胞活力=0.271)和S4-A(細胞活力=0.252)也顯著抑制U87細胞活力。為了進一步驗證高通量篩選結(jié)果,我們進一步采用了人膠質(zhì)瘤細胞系U87,人膠質(zhì)瘤細胞系M059K以及人膠質(zhì)瘤細胞系U251和人原代膠質(zhì)瘤細胞,驗證NF-κB抑制劑對其細胞活力的影響,CCK-8的檢測結(jié)果如圖2顯示,經(jīng)過不同NF-κB抑制劑CAPE、JSH-23、S4-A分別處理后的人膠質(zhì)瘤細胞系U87,M059K和U251以及人原代膠質(zhì)瘤細胞,細胞活力均出現(xiàn)了顯著下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)使用不同NF-κB抑制劑處理人膠質(zhì)瘤細胞24h后,CCK-8的檢測結(jié)果顯示,NF-κB抑制劑CAPE、JSH-23、S4-A均能夠顯著抑制人膠質(zhì)瘤細胞系U87,M059K和U251以及人原代膠質(zhì)瘤細胞的細胞活力,結(jié)果均具有顯著性差異(p0.05),其中CAPE對U87細胞增殖的抑制作用最顯著。Brdu法檢測結(jié)果顯示,NF-κB抑制劑CAPE、JSH-23、S4-A均能夠顯著抑制人膠質(zhì)瘤細胞系U87,M059K和U251以及人原代膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力,結(jié)果均具有顯著性差異(p0.05),其中CAPE對U87細胞增殖的抑制作用最顯著。Hoechst染色結(jié)果顯示,空白對照組的膠質(zhì)瘤細胞經(jīng)Hoechst染色后發(fā)出藍色熒光,形態(tài)表現(xiàn)為圓形或橢圓形,而經(jīng)過不同NF-κB抑制劑CAPE、JSH-23、S4-A分別處理后的人膠質(zhì)瘤細胞系U87,M059K和U251以及人原代膠質(zhì)瘤細胞均出現(xiàn)了顯著的細胞核形態(tài)改變,表現(xiàn)為核固縮、核凝結(jié)、染色質(zhì)碎裂,染色團塊聚集緊密、熒光增強并且出現(xiàn)凋亡小體等改變,表明NF-κB抑制劑促進人膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。TUNEL檢測結(jié)果顯示,經(jīng)過NF-κB抑制劑CAPE、JSH-23、S4-A分別處理后的人膠質(zhì)瘤細胞系U87,M059K和U251以及人原代膠質(zhì)瘤細胞的凋亡比例均出現(xiàn)顯著增加,其中CAPE處理U87細胞后凋亡比例最高。(3)使用不同NF-κB抑制劑處理人膠質(zhì)瘤細胞24h后,檢測結(jié)果顯示,NF-κB抑制劑CAPE、JSH-23、S4-A均能夠顯著抑制人膠質(zhì)瘤細胞系U87,M059K和U251中TNF-αmRNA的合成以及TNF-α因子的釋放,PCR的檢測結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果趨勢一致,均具有顯著性差異(p0.05)。NF-κB抑制劑CAPE、JSH-23、S4-A均能夠顯著促進人膠質(zhì)瘤細胞系U87,M059K和U251以及人原代膠質(zhì)瘤細胞中Caspase-3/7的激活,均具有顯著性差異(p0.05)。NF-κB抑制劑CAPE、JSH-23、S4-A均能夠顯著抑制人膠質(zhì)瘤細胞系U87,M059K和U251以及人原代膠質(zhì)瘤細胞中p65 NF-κB的磷酸化,均具有顯著性差異(p0.05)。而對STAT1的磷酸化水平無影響。(4)對照組的裸鼠在接種人膠質(zhì)瘤U87細胞后,腫瘤生長速度快,NF-κB抑制劑CAPE組的裸鼠生長速度相對緩慢,從第14天開始,兩組裸鼠的膠質(zhì)瘤體積有顯著差異(p0.05),并且隨著接種時間的延長,兩組裸鼠的膠質(zhì)瘤體積差異也逐漸增大。在接種4周后,對照組裸鼠膠質(zhì)瘤體積為251.3±41.4mm~3,CAPE組體積僅為91.3±9.36mm~3。接種膠質(zhì)瘤細胞后,對照組裸鼠從第16天開始出現(xiàn)死亡,CAPE組裸鼠從第18天開始出現(xiàn)死亡,至第28天,對照組裸鼠生存率降低至0%,CAPE組裸鼠的生存率為50%,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01)。組織病理學檢測結(jié)果顯示,對照組裸鼠的膠質(zhì)瘤細胞豐富密集,形態(tài)正常,細胞凋亡數(shù)量少,而CAPE組裸鼠的膠質(zhì)瘤細胞密度相對減少,部分細胞形態(tài)異常,出現(xiàn)核固縮等凋亡的形態(tài)學改變,部分組織可見壞死。U87細胞接種裸鼠第28天后,NF-κB抑制劑CAPE組裸鼠的膠質(zhì)瘤組織中TNF-α濃度為412.5±52.3pg/ml,顯著低于對照組裸鼠(p0.05);CAPE組裸鼠的Caspase-3/7的蛋白活性增長顯著升高至451.2±61.9%,顯著高于對照組裸鼠(p0.01);CAPE組裸鼠的p65 NF-κB的磷酸化水平增長顯著低于對照組裸鼠(p0.05)。研究結(jié)論(1)經(jīng)過高通量篩選得到的NF-κB抑制劑CAPE、JSH-23、S4-A均能顯著抑制多種人膠質(zhì)瘤細胞的增殖,并促進人膠質(zhì)瘤細胞的凋亡,揭示了NF-κB抑制劑對人膠質(zhì)瘤細胞惡性生物學行為特征的抑制作用,為后續(xù)研究提供了實驗基礎。(2)NF-κB抑制劑能夠抑制人膠質(zhì)瘤細胞p65NF-κB的活化,從而減少TNF-α的釋放和增強Caspase-3/7的激活,最終抑制人膠質(zhì)瘤細胞的增殖并促進其凋亡水平。(3)CAPE能顯著抑制裸鼠體內(nèi)膠質(zhì)瘤的腫瘤體積,誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡,其作用與抑制TNF-α因子釋放,促進Caspase-3/7活化,抑制NF-κB通路激活等相關,表明NF-κB抑制劑CAPE具有體內(nèi)抗惡性膠質(zhì)瘤作用,有望為其臨床應用的轉(zhuǎn)化提供實驗證據(jù)。
【學位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R739.41
【圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學博士學位論文 實驗結(jié)果2.3.1 候選藥物熱點圖分析經(jīng)過初步篩選，我們將 Target Selective Inhibitor Library 中的候選藥物作用于間的差異通過細胞活力以不同的顏色在熱點圖（Hit map）里進行區(qū)分，根據(jù)1 所示，抑制 U87 細胞活力的前 5 種化學物質(zhì)分別為 CAPE（細胞活力＝0.16ptotanshinone（細胞活力＝0.191）、PF-5274857（細胞活力＝0.197）、Pifith胞活力＝0.201）和 Tenovin-6（細胞活力＝0.202）。CAPE 是 NF-κB 抑制劑種 NF-κB 抑制劑 JSH-23 （細胞活力=0.271）和 S4-A（細胞活力=0.252）也 U87 細胞活力。

陸軍軍醫(yī)大學博士學位論文細胞系 M059K 以及人膠質(zhì)瘤細胞系 U251 和人原代膠質(zhì)瘤細胞，驗證 NF-κB 抑對其細胞活力的影響。CCK-8的檢測結(jié)果如圖2顯示，經(jīng)過不同NF-κB抑制劑CAPH-23、S4-A 分別處理后的人膠質(zhì)瘤細胞系 U87， M059K 和 U251 以及原代膠質(zhì)胞后，細胞活力均出現(xiàn)了顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖 3. NF-κB 抑制劑對人膠質(zhì)瘤細胞凋亡水平的影響（Hoechst33342 染色，×200）。Fig 3. Effects of NF-κB inhibitors on apoptosis of human glioma cells (Hoechst33342 staining, ×2003.3.4NF-κB 抑制劑誘導人膠質(zhì)瘤細胞凋亡（TUNEL 檢測）TUNEL 檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過 NF-κB 抑制劑 CAPE、JSH-23、S4-A 分別處理后膠質(zhì)瘤細胞系 U87，M059K 和 U251 以及人原代膠質(zhì)瘤細胞的凋亡比例均出現(xiàn)顯加，其中 CAPE 處理 U87 細胞后凋亡比例最高。RelativeTUNEL(%ofcontrol)01 02 03 04 05 0U 8 7M 0 5 9 KU 2 5 1P r im a r y g l io m a c e ll sCAPE - + - -JSH-23 - - + -S4-A - - - +- + - -- - + -- - - +- + - -- - + -- - - +- + - -- - + -- - - +************ *圖 4. NF-κB 抑制劑對人膠質(zhì)瘤細胞凋亡水平的影響（TUNEL 法）。*p<0.05 與空白對照組

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 張紀;深入開展膠質(zhì)瘤綜合治療及其基礎研究[J];中華神經(jīng)外科雜志;2003年01期

本文編號：2794181