【摘要】：研究目的帕金森病(Parkinson'sdisease,PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病,患病率高且逐年上升。PD確切發(fā)病機制未明,與PD相關(guān)的環(huán)境因素中,農(nóng)藥暴露受到廣泛關(guān)注,其中百草枯(paraquat,PQ)和代森錳(maneb,MB)均被證明與PD發(fā)生有關(guān)。PQ作為除草劑廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。近年來的流行病學(xué)資料提-示,來自職業(yè)、飲水及食物等途徑慢性低劑量PQ暴露能夠增加PD、阿爾茲海默病(Alzheimer'sdisease,AD)等慢性神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病風(fēng)險。PQ可以透過血腦屏障進入腦內(nèi),產(chǎn)生大量超氧自由基,損傷內(nèi)源性抗氧化功能,呈現(xiàn)神經(jīng)毒性作用。MB是常用于農(nóng)業(yè)消毒的殺真菌劑。MB中錳元素和除錳之外的母體化合物均有神經(jīng)毒性作用,且與PD發(fā)生相關(guān)。MB可以引起線粒體功能失衡,導(dǎo)致細胞氧化損傷誘發(fā)神經(jīng)毒性。目前,PQ和MB二者聯(lián)合慢性染毒已成為構(gòu)建PD動物模型的公認方法,但PQ與MB聯(lián)合的神經(jīng)毒性機制尚不完全清楚,也缺乏預(yù)防和治療中毒的特效藥物。流行病學(xué)調(diào)查和實驗研究均發(fā)現(xiàn)PQ和MB能引起腦內(nèi)異常。長期低劑量接觸包括PQ、MB在內(nèi)的多種農(nóng)藥能升高PD患病率。實驗觀察到PQ與MB導(dǎo)致大腦氧化應(yīng)激,NF-κB磷酸化水平升高,小膠質(zhì)細胞激活。已知小膠質(zhì)細胞的活化分為具有促炎作用的M1型極化和抗炎作用的M2型極化。尤其近年來發(fā)現(xiàn)一種新的細胞程序性死亡方式——細胞焦亡(pyroptosis),在CNS疾病中起到重要作用。相比于細胞凋亡(apoptosis),細胞焦亡發(fā)生的更快,是一種依賴半胱氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-1)的炎性死亡,主要伴隨大量促炎癥因子白細胞介素1β(interleukin,IL-1β)的釋放。PQ與MB聯(lián)合作用引起的中樞損傷是否與小膠質(zhì)細胞M1/M2型極化失衡相關(guān),是否存在神經(jīng)元焦亡,目前尚未見報道。因此在本實驗研究中,我們觀察了染毒小鼠大腦小膠質(zhì)細胞的激活和神經(jīng)元焦亡情況,檢測了 M1型和M2型極化標(biāo)志性分子變化趨勢,觀察了中腦及腦橋-延髓內(nèi)NLRP3和caspase-1表達,以及NF-κB激活情況和ROS含量變化。進一步觀察了格列本脲(glibenclamide,Gli)對PQ與MB聯(lián)合毒性的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)作用,通過檢測小鼠神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn),中腦及腦橋-延髓中上述指標(biāo)是否發(fā)生改變,評價Gli對聯(lián)合毒性的預(yù)防效果,進一步探討NLRP3炎性小體介導(dǎo)的神經(jīng)元焦亡在PQ與MB聯(lián)合慢性毒性誘導(dǎo)PD樣癥狀中的作用。研究方法1.實驗動物分組和處理:(1)預(yù)防實驗:100只C57BL/6雄性8周齡SPF級小鼠,體重18～20 g,適應(yīng)性喂養(yǎng)5天,隨機分為對照組、PQ+MB染毒組、PQ+MB+Gli干預(yù)組、Gli對照組,每組25只。動物染毒前腹腔注射Gli,劑量為10mg/kg.bw,30 min后,PQ與MB分別按照10mg/kg.bw、30mg/kg.bw經(jīng)腹腔注射染毒,2次/周,連續(xù)8周。染毒結(jié)束,部分小鼠取腦組織用于病理切片觀察,部分小鼠經(jīng)眼球放血處死后剝離中腦、腦橋-延髓等部位。(2)治療實驗:92只SPF級C57BL/6雄性8周齡小鼠(18～20g),適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后,按體重隨機分為對照組、PQ+MB染毒組,每組46只。PQ與MB分別按照10mg/kg.bw、30mg/kg.bw經(jīng)腹腔注射染毒,對照組給予等體積溶劑,2次/周,連續(xù)8周,建立PD樣CNS損傷的動物模型。自第10周起PQ+MB染毒組動物平均分為Gli治療組和溶劑對照組,Gli劑量10 mg/kg.bw,經(jīng)腹腔注射給予,2次/周,連續(xù)5周。另一組給予等體積的溶劑。對照組也相應(yīng)分為Gli對照組和空白對照組,Gli和溶劑給予同上。實驗結(jié)束次日晨處死動物,部分小鼠取腦組織用于病理切片觀察,部分小鼠經(jīng)眼球放血處死后剝離中腦、腦橋-延髓等部位進行檢測。2.轉(zhuǎn)棒疲勞測試:分別于實驗第2、4、6、8、12、14周末進行轉(zhuǎn)棒實驗,小鼠由轉(zhuǎn)棒上脫落時儀器自動記錄潛伏期。每組測試10只小鼠。3.糞便收集實驗:分別于實驗第2、4、6、8、12、14周末收集動物糞便。收集時間為60 min,記錄排便粒數(shù),根據(jù)糞便濕重和干重,計算糞便含水量。4.免疫組化檢測:制備各組動物腦的冰凍切片,采用免疫組化法觀察中腦小膠質(zhì)細胞形態(tài)。5.qPCR檢測:檢測各組小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞M1/M2極化的關(guān)鍵分子IL-1β、iNOS、TNF-α、Arginase-1、YM-1、CD206mRNA 表達,以及 NLRP3 炎性小體中NLRP3、caspase-1mRNA表達量的變化。6.Western blot檢測:檢測小鼠中腦和腦橋-延髓中iNOS、Arginase-1、Iba-1、NLRP3、IL-1β、caspase-1p10、NF-κB、磷酸化NF-κB 的相對蛋白表達量。7.熒光染料法ROS檢測:采用熒光染料,檢測小鼠腦內(nèi)ROS的含量。結(jié)果1.PQ與MB聯(lián)合作用及Gli對大鼠體重影響:與對照組相比,PQ+MB染毒組、Gli預(yù)防與治療組體重均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。2.PQ與MB聯(lián)合作用及Gli對小鼠神經(jīng)行為學(xué)影響:(1)預(yù)防實驗:轉(zhuǎn)棒疲勞測試中,與對照組相比,PQ+MB染毒組小鼠轉(zhuǎn)棒潛伏期明顯減少(P0.01),Gli預(yù)防可明顯改善染毒小鼠運動協(xié)調(diào)能力,Gli預(yù)防組潛伏期明顯高于染毒組(P0.05)。糞便收集實驗中,PQ+MB染毒組糞便含水量和排便粒數(shù)明顯低于對照組(P0.05),Gli作為預(yù)防藥物有效的增加了排便粒數(shù)(P0.05),糞便含水量較染毒組有上升趨勢。提示Gli可以預(yù)防PQ+MB導(dǎo)致的便秘癥狀。(2)治療實驗:轉(zhuǎn)棒疲勞測試中,PQ+MB染毒組小鼠轉(zhuǎn)棒潛伏期從第4周起有下降趨勢,第8周時明顯低于對照組(P0.01)。自第8周給予Gli治療,至第14周末時,PQ+MB染毒動物的轉(zhuǎn)棒潛伏期與對照動物均有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。糞便收集實驗中,自第2周起,PQ+MB染毒組小鼠糞便含水量和排便粒數(shù)較對照組明顯降低(P0.01),給予Gli治療能夠改善染毒動物的便秘情況,第12周時,Gli治療組動物糞便含水量和排便粒數(shù)高于染毒組(P0.01)。3.PQ與MB聯(lián)合作用對小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)影響:PQ+MB染毒小鼠小膠質(zhì)細胞胞體明顯增大,呈圓形,偽足明顯,呈現(xiàn)“阿米巴樣”變化,提示小膠質(zhì)細胞被激活,Gli預(yù)防和治療后活化均明顯減弱。4.PQ與MB聯(lián)合作用對小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞極化的影響:動物給予PQ與MB聯(lián)合染毒,小鼠腦內(nèi)Iba-1、iNOS較對照組明顯升高(P0.05),染毒組中腦、腦橋-延髓內(nèi)TNF-αmRNA表達明顯增高(P0.01)。提示PQ+MB染毒可導(dǎo)致小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞M1極化。PQ+MB染毒組小鼠中腦Arginase-1 mRNA表達量也較對照組明顯增高(P0.05,P0.01),腦橋-延髓中CD206mRNA表達高于對照組(P0.01),提示染毒可引起部分小膠質(zhì)細胞M2極化。染毒同時給予Gli預(yù)防可明顯抑制小膠質(zhì)細胞活化,Gli預(yù)防組腦橋-延髓中Iba-1表達量低于染毒組(P0.01)。Gli預(yù)防組中腦、腦橋-延髓中TNF-α mRNA和iNOS蛋白表達均較PQ+MB 染毒組明顯降低(P0.01),但對 Arginase-1、YM-1、CD206 mRNA 表達影響不大。5.PQ與MB聯(lián)合作用對小鼠腦內(nèi)NLRP3炎性小體激活及神經(jīng)元焦亡的影響:與對照組相比,PQ+MB組腦內(nèi)NLRP3、IL-1β、caspase-1 mRNA表達量有升高趨勢,IL-1β、caspase-1 mRNA表達量有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01,P0.05),PQ+MB染毒組NLRP3、成熟IL-1p、caspase-1p10蛋白水平均高于對照組(P0.05)。與PQ+MB組相比,Gli預(yù)防組腦內(nèi)NLRP3、IL-1β、caspase-1mRNA表達有降低趨勢(P0.05),但三者蛋白表達水平較PQ+MB組明顯降低(P0.01,P0.05)。給予Gli治療后,NLRP3、IL-1β、caspase-1mRNA表達有較PQ+MB組降低趨勢,蛋白表達也較染毒組顯著降低(P0.05)。6.PQ與MB聯(lián)合作用對小鼠腦內(nèi)NF-κB激活的影響:與對照組相比,PQ+MB染毒組NF-κB和磷酸化NF-κB蛋白表達均明顯增高(P0.05,P0.01).Gli預(yù)防組中腦NF-κB和磷酸化NF-κB較PQ+MB組有降低趨勢,Gli可以顯著降低腦橋-延髓部位磷酸化NF-κB含量(P0.01)。Gli治療可以有效降低NF-κB和磷酸化NF-κB蛋白水平(P0.05)。7.PQ與MB聯(lián)合作用對小鼠腦內(nèi)ROS含量的影響:PQ+MB組小鼠腦內(nèi)ROS含量較對照組升高(P0.05),提示PQ與MB染毒可能導(dǎo)致了小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)發(fā)生,Gli預(yù)防組和治療組小鼠腦內(nèi)ROS均明顯少于染毒組(P0.01,P0.05)。結(jié)論1.PQ與MB聯(lián)合染毒可導(dǎo)致實驗動物出現(xiàn)PD樣癥狀,動物腦內(nèi)神經(jīng)細胞焦亡。2.PQ與MB聯(lián)合慢性毒性可使腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞M1型極化、M1/M2極化失衡,導(dǎo)致神經(jīng)炎癥反應(yīng)。3.K+通道抑制劑格列本脲能有效預(yù)防PQ與MB誘導(dǎo)的動物腦內(nèi)炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元焦亡。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R742.5
【圖文】：

１．２神經(jīng)行為學(xué)結(jié)果逡逑１．２．１轉(zhuǎn)棒疲勞測試結(jié)果逡逑由圖２可見，與對照組相比，ＰＱ＋ＭＢ染毒組小鼠轉(zhuǎn)棒潛伏期明顯減少逡逑（尸＜０．０１），同時給予Ｇｌｉ，能夠有效改善動物的運動協(xié)調(diào)能力，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)棒潛伏逡逑期明顯高于染毒組（Ｐ＜０．０５）。逡逑＾邋２００邋ｎ逡逑－0邐＋邋ＣＯＮ邋ＰＢＳ逡逑0逡逑0３邐了邐Ｔ邐ＰＱ＇＋ＭＢ逡逑？Ｉ邋１５０－邐邐邐－１，邋＃邐ＰＱ＋ＭＢ＋Ｇｌｉ逡逑１邐＋邋ＣＯＮ．Ｇｌｉ逡逑”。。．＿ｊ＊＊逡逑￡邐，邐N逡逑－逡逑￡邋邐１邐１邐１邐１邐逡逑卜邐２邐４邐６邐８邐Ｔｉｍｅ邋（ｗｅｅｋ）逡逑注：與對照組相比，“ＦｃＯ．Ｏｌ，與ＰＱ＋ＭＢ染毒組相比，９＜０．０５。逡逑圖２各組小鼠轉(zhuǎn)棒潛伏期逡逑３２逡逑

１．３．１小鼠中腦小膠質(zhì)細胞活化情況逡逑１．３．１．１各組小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)變化逡逑如圖４，邋ＰＱ＋ＭＢ染毒組小鼠中腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞胞體增大，偽足明顯，呈現(xiàn)逡逑“阿米巴樣”變化，提示小膠質(zhì)細胞被激活，Ｇｌｉ預(yù)防后活化明顯減弱。逡逑、ＨＵＨ邋、逡逑．邋－＊邋＊邋＾邋？逡逑．邐－邐＊邐’邋ｉ逡逑ＣＯＮ－ＰＢＳ邐ＰＱ＾ＭＢ邐ＰＱ＾ＭＢ＋Ｇｌｉ邐ＣＯＮ－Ｇｌｉ逡逑注：白色箭頭為小膠質(zhì)細胞己激活，黑色箭頭為未激活狀態(tài)。逡逑圖４小鼠中腦小膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)變化（２００Ｘ）逡逑１．３．１．２中腦小膠質(zhì)細胞Ｍｌ型極化情況逡逑①ｉＮＯＳ、ＴＮＦ－ａｍＲＮＡ表達：如圖５所示，ＰＱ＋ＭＢ染毒使中腦內(nèi)ＴＮＦ－ａ逡逑ｍＲＮＡ表達明顯升高（ＰＯ．ＯＳ），ｉＮＯＳ有上升趨勢（Ｐ＞０．０５），Ｇｌｉ預(yù)防組逡逑ｍＲＮＡ較ＰＱ＋ＭＢ染毒組降低（ＦＯ．Ｏｌ邋）。逡逑３３逡逑

圖４小鼠中腦小膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)變化（２００Ｘ）逡逑１．３．１．２中腦小膠質(zhì)細胞Ｍｌ型極化情況逡逑①ｉＮＯＳ、ＴＮＦ－ａｍＲＮＡ表達：如圖５所示，ＰＱ＋ＭＢ染毒使中腦內(nèi)ＴＮＦ－ａ逡逑ｍＲＮＡ表達明顯升高（ＰＯ．ＯＳ），ｉＮＯＳ有上升趨勢（Ｐ＞０．０５），Ｇｌｉ預(yù)防組逡逑ｍＲＮＡ較ＰＱ＋ＭＢ染毒組降低（ＦＯ．Ｏｌ邋）。逡逑３３逡逑

【參考文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 姜路路;藍斑核去甲腎上腺素在帕金森病發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究[D];山東大學(xué);2016年

本文編號：2790497