【摘要】：【背景】中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)脫髓鞘疾病包括有視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSDs)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)、長(zhǎng)節(jié)段橫貫性脊髓炎(Longitudinally Extensive Transverse Myelitis,LETM)、視神經(jīng)炎(optic neuritis,ON)等。目前臨床上最常見(jiàn)的是視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病與多發(fā)性硬化。上述兩者在發(fā)病機(jī)制,病理改變及治療上都存在著差異。自從2004年有外國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)抗體后,該抗體被公認(rèn)為NMOSDs最敏感且特異的免疫標(biāo)志物。雖然該抗體的發(fā)現(xiàn)對(duì)鑒別NMOSDs與MS具有重要的指導(dǎo)意義,但臨床上仍有10-40%的NMOSDs患者血清中檢測(cè)不到該抗體。目前的研究表明這部分AQP4抗體陰性的NMOSDs患者的病因尚未明確,猜測(cè)可能有其他抗體參與或介導(dǎo)NMOSDs的病理過(guò)程,CRMP5(collapsin response mediator protein 5)抗體就可能是其中一種。第一部分:CRMP5的質(zhì)粒組成及293T細(xì)胞模型的構(gòu)建【目的】構(gòu)建CRMP5質(zhì)粒,將人CRMP5基因進(jìn)行擴(kuò)增后轉(zhuǎn)染進(jìn)人胚腎(human embryonic kidney,HEK)293T細(xì)胞內(nèi),構(gòu)建出細(xì)胞模型并用于血清CRMP5抗體的檢測(cè)�！痉椒ā�1.pEnter-CRMP5質(zhì)粒的構(gòu)建1.1.引物設(shè)計(jì)與合成通過(guò)軟件Premier 5.0進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)并參照Genebank中公布的人CRMP5基因序列,分別設(shè)計(jì)CRMP5基因的上游及下游引物,其中上游含ASCI引物酶,下游含NotI引物酶,以18s rRNA為內(nèi)參,送廣州銘善上生物公司進(jìn)行合成。1.2.人CRMP5基因的獲取通過(guò)賽默飛公司的RNA提取試劑盒提取人體細(xì)胞的總核糖核苷酸(ribonucleic acid,RNA),為確保提取RNA的純度和完整性需對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。之后用上述合成的CRMP5引物和人總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,從而得到它們的互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA),再以CRMP5-cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增。然后將PCR產(chǎn)物回收,進(jìn)行凝膠電泳來(lái)鑒定目的基因是否擴(kuò)增成功。1.3.酶切及質(zhì)粒構(gòu)建將CRMP5-cDNA的PCR回收產(chǎn)物及pEnter載體分別用ASC I與Not I限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切,將CRMP5基因與pEnter載體通過(guò)T4連接酶進(jìn)行連接后獲得CRMP5-pEnter質(zhì)粒,再以DH5α感受態(tài)細(xì)胞為底物,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入內(nèi)。將所得混合物加入含卡那霉素的LB平板內(nèi),置于含二氧化碳的37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng),挑取單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后,通過(guò)Endo-free Plasmid Mini Kit II 50質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取并用于鑒定陽(yáng)性克隆,同時(shí)以pEnter空載體做對(duì)照。1.4.pEnter-CRMP5質(zhì)粒的鑒定將提取后的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切篩選,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒的完整性。然后將其送至廣州銘善上公司進(jìn)行基因測(cè)序,對(duì)GeneBank中人CRMP5基因序列和銘善上公司的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行Blast對(duì)比。2.CRMP5-293T細(xì)胞模型的構(gòu)建將凍存在液氮的HEK 293T細(xì)胞復(fù)蘇并進(jìn)行培養(yǎng),轉(zhuǎn)染前1天對(duì)培養(yǎng)的293T細(xì)胞進(jìn)行傳代,培養(yǎng)至融合度達(dá)70-80%時(shí),通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000將CRMP5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。pEnter空載體做對(duì)照。3.CRMP5的表達(dá)鑒定轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞通過(guò)Western blotting和間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence assay,IIFA)鑒定CRMP5在293T細(xì)胞上的表達(dá)情況。成功構(gòu)建的CRMP5-293T細(xì)胞模型將用于血清CRMP5抗體的檢測(cè)。【結(jié)果】1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳鑒定:CRMP5-cDNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳鑒定,結(jié)果圖中可見(jiàn)與理論值一致的條帶(CRMP5:1695bp)。2.CRMP5質(zhì)粒的鑒定2.1.質(zhì)粒酶切凝膠電泳鑒定:電泳圖顯示在相應(yīng)理論值附近出現(xiàn)清晰的條帶,證明CRMP5質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.2.基因測(cè)序分析鑒定:將基因測(cè)序結(jié)果與BLAST上的序列進(jìn)行比對(duì),原始序列與已知序列100%符合。3.CRMP5在細(xì)胞上的表達(dá):Western blotting鑒定可見(jiàn)CRMP5-293T細(xì)胞表達(dá)蛋白在65kDa附近出現(xiàn)特異性條帶。細(xì)胞經(jīng)IIF法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與CRMP5陽(yáng)性抗體結(jié)合的細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)激發(fā)紅色熒光,與4'6-二脒基-2-苯基吲哚(4'6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染核疊加。而pEnter空載細(xì)胞,293T細(xì)胞以及空白對(duì)照的細(xì)胞上未見(jiàn)相應(yīng)熒光模式�！窘Y(jié)論】成功克隆人CRMP5基因,構(gòu)建CRMP5-293T表達(dá)質(zhì)粒,并在293T細(xì)胞上穩(wěn)定表達(dá),提示已經(jīng)成功地構(gòu)建出CRMP5-293T細(xì)胞模型。這是一種可靠的檢測(cè)患者血清抗體的實(shí)驗(yàn)方法,為進(jìn)一步深入研究NMOSDs可能存在的發(fā)病機(jī)制及病理變化提供有用的實(shí)驗(yàn)根據(jù)。第二部分:CNS脫髓鞘疾病患者血清CRMP5抗體檢測(cè)【目的】通過(guò)構(gòu)建的CRMP5-293T細(xì)胞模型檢測(cè)CNS炎性脫髓鞘疾病患者血清中的CRMP5抗體,探索CRMP5抗體與該類疾病的關(guān)系。【方法】1.病例及血清收集收集2016年12月到2017年12月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院診斷為CNS脫髓鞘疾病的患者共62例,所有患者均已進(jìn)行血清AQP4抗體的檢測(cè)。包括:NMOSDs 16例,MS 13例,其他炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病(other inflammatory neurological disease,OIND)患者15例、其他非炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病(other non-inflammatory neurological disease,OND)患者18例,另有健康對(duì)照20人。所有患者均未使用免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素治療,并在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈取血。2.血清中CRMP5抗體的檢測(cè)基于細(xì)胞法(cell based assay,CBA)的間接免疫熒光方法檢測(cè)患者血清中的CRMP5抗體,所用二抗為花青素?zé)晒?(cyanine,CY3)標(biāo)記鼠抗人IgG。3.商業(yè)型免疫印跡試劑盒驗(yàn)證細(xì)胞法檢測(cè)的結(jié)果通過(guò)商業(yè)型免疫印跡試劑盒(神經(jīng)元抗原譜2抗體(IgG)檢測(cè)試劑盒)(EUROIMMUN,Neuronal Antigens Profile 2 EUROLINE)對(duì)上述所有標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),可見(jiàn)CBA法檢測(cè)CRMP5抗體陽(yáng)性的患者血清在印跡條上出現(xiàn)與理論值相符的目標(biāo)條帶,而抗體陰性患者未見(jiàn)目標(biāo)條帶,進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞模型的成功建立及患者血清CRMP5呈陽(yáng)性。4.統(tǒng)計(jì)分析所有結(jié)果經(jīng)過(guò)社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包(statistical package for social sciences,SPSS)16.0進(jìn)行分析處理。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)為分類變量資料,組間陽(yáng)性率進(jìn)行X~2檢驗(yàn),p小于0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。【結(jié)果】CRMP5抗體與CNS脫髓鞘疾病的關(guān)系細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)16例視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(NMOSDs),陽(yáng)性1例(6.25%);13例MS患者血清,陽(yáng)性1例(7.69%);15例其他炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病(OIND),陽(yáng)性0例(0%);18例其他非炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病(OND),陽(yáng)性0例(0%);20例健康人對(duì)照,陽(yáng)性0例(0%)。采用商業(yè)型免疫印跡試劑盒檢測(cè)上述血清結(jié)果與CBA法檢測(cè)結(jié)果完全一致。最后采用卡方檢驗(yàn)評(píng)估各組陽(yáng)性率,結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.316)。【結(jié)論】成功地構(gòu)建了一種基于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法來(lái)檢測(cè)血清中的CRMP5抗體,有助于臨床診斷CRMP5抗體相關(guān)性疾病。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R744.5
【圖文】：

P5 質(zhì)粒的構(gòu)建和 CRMP5-293T 細(xì)胞模的條帶(圖 3)。由所作的灰度分3T 細(xì)胞和空載體 pcDNA3.1+ IIFA（indirect immunofluoresce表達(dá) CRMP5 蛋白并與一抗（小二抗結(jié)合反應(yīng)后在細(xì)胞質(zhì)和胞合，而在空載細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染質(zhì)光。證明轉(zhuǎn)染 CRMP5-293T 細(xì)胞附 圖

在 CRMP5 基因（1695bp）標(biāo)記附近出現(xiàn)清晰的條帶，說(shuō)明 CRMP5 基因已成功載入 pEnter 質(zhì)粒中。（圖2）1.3.CRMP5 質(zhì)�；驕y(cè)序鑒定將提取的 CRMP5 質(zhì)粒送至廣州銘善上生物公司進(jìn)行基因測(cè)序，將所得結(jié)果與Genbank 中的人 CRMP5 基因序列進(jìn)行 BLAST 對(duì)比分析可知：基因 CRMP5(1695bp)已成功克隆入至載體 pEnter 中，原始序列與 Genbank 中的已知序列 100%符合，提示該質(zhì)�？捎糜诤罄m(xù)的實(shí)驗(yàn)。2. CRMP5 在 293T 細(xì)胞中的表達(dá)鑒定2.1.Western blotting 法鑒定采用Western blotting實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定CRMP5的蛋白表達(dá)量，可檢測(cè)到在分子量65kDa附近處出現(xiàn) CRMP5-293T 細(xì)胞的特異性條帶，而 293T 細(xì)胞及空載體 pcDNA3.1+ 處并未檢測(cè)到特異性條帶。以 GAPDH 為內(nèi)參，分子大小約為 36 kDa，在各組 36 kDa 大小

2: 雙酶切鑒定 CRMP5 質(zhì)粒泳道 M1：1kb DNA Ladder Marker；泳道 1：分別為 CRMP5-1 的質(zhì)粒酶切后產(chǎn)物；泳道 2：分別為 CRMP5-2 的質(zhì)粒酶切后產(chǎn)物；泳道 3：分別為 CRMP5-3 的質(zhì)粒酶切后產(chǎn)物；泳道 4：分別為 CRMP5-4 的質(zhì)粒酶切后產(chǎn)物；泳道 M2：DL2000 DNA Marker酶切結(jié)果分析：CRMP5（1695bp）在相應(yīng)的位置切出一條目的條帶（紅色箭頭所指到有陽(yáng)性克隆，送 CRMP5 陽(yáng)性質(zhì)粒去測(cè)序。

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1 梁俊彥;CRMP5-293T細(xì)胞模型的構(gòu)建及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病中的意義[D];廣州醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2788182