【摘要】：背景應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,在細(xì)胞、組織、血液等體液中篩選出蛋白質(zhì)表達(dá)譜,鑒定出有助于臨床上診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。以質(zhì)譜(Mass Spectrometry,MS)分析技術(shù)是一種高效的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法。本研究利用高效液相色譜儀(High-Performance Liquid Chromatography,HPLC)聯(lián)合The quadrupole Orbitrap mass spectrometer質(zhì)譜儀(Q Exactive),篩選出早期帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)組、中晚期PD組這兩組實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血漿樣本之間表達(dá)水平具有差異性的蛋白質(zhì),尋找可能早期診斷帕金森病的生物學(xué)標(biāo)志物。目的利用Q-Exactive質(zhì)譜儀為基礎(chǔ)上的質(zhì)譜技術(shù),篩選PD臨床診斷和干預(yù)相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物。方法1臨床樣本的采集及制備選擇2016年7月至2017年3月于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的PD患者33例,按照疾病分期將患者分為早期PD組(n=19)和中晚期PD組(n=14)。另選取同期36例健康體檢者作為對(duì)照組。分別選取6名早期PD、6例中晚期PD、6例對(duì)照者的血漿樣本,經(jīng)過去除血漿中的高豐度蛋白質(zhì)、蛋白濃縮、蛋白定量,于每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本取出100μg相繼進(jìn)行蛋白還原及烷基化反應(yīng),加入1.5μg胰蛋白酶至每個(gè)樣本中,37℃恒溫箱中酶解過夜,酶解產(chǎn)物經(jīng)過凍干及重溶,加入不同濃度梯度的乙腈至C18填充的固相萃取柱對(duì)樣本進(jìn)行脫鹽處理。2液相分離及質(zhì)譜檢測(cè)利用富集柱對(duì)多肽樣品進(jìn)行富集,經(jīng)過高溫電離及電壓霧化后進(jìn)入QE質(zhì)譜機(jī)器中進(jìn)行檢測(cè),收集離子信號(hào)。離子信號(hào)經(jīng)過軟件處理并進(jìn)行搜庫。篩選出在每組6例中均出現(xiàn)、表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的多肽作為最終結(jié)果(P0.05)。3生物信息學(xué)分析我們利用R語言中的Cluster Profiler包對(duì)表達(dá)水平差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白進(jìn)行功能富集,主要包括Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集,對(duì)生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分富集分別做分析Gene Ontology(GO)功能富集,以及蛋白質(zhì)互作分析。4差異蛋白的ELISA驗(yàn)證為了驗(yàn)證質(zhì)譜分析的結(jié)果,我們擴(kuò)大樣本。利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)(Linked Immunosorbent Assay,ELISA),對(duì)三個(gè)表達(dá)具有顯著性的蛋白,載脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE)、過氧化物酶-2(peroxiredoxin-2,PRDX2),炎性反應(yīng)蛋白補(bǔ)體C7(complement component 7,C7)進(jìn)一步進(jìn)行定量驗(yàn)證,求得相應(yīng)樣品所含有的蛋白濃度。結(jié)果我們篩選出97個(gè)早期組血漿中表達(dá)差異的蛋白質(zhì);篩選出68個(gè)中晚期組血漿中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。通過生物信息學(xué)對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析后,發(fā)現(xiàn)這些蛋白功能主要與氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、補(bǔ)體激活、神經(jīng)突觸再生等相關(guān);ELISA結(jié)果:早期組和對(duì)照組中的受試者血漿中C7蛋白水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。早期PD組患者血漿中APOE蛋白水平均低于對(duì)照組(P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;早期PD組患者血漿中PRDX2蛋白水平低于對(duì)照組(P0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1 PD患者與對(duì)照組血漿中蛋白質(zhì)表達(dá)水平存在一定的差異性。2 APOE和PRDX2可能作為早期診斷帕金森病的標(biāo)志物,仍需擴(kuò)大樣本驗(yàn)證。
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R742.5
【圖文】：

針對(duì)早期 PD 組與中晚期 PD 組分別與對(duì)照組比較，對(duì)這兩組行 GO 分子功能分析兩組中的差異蛋白的顯著的分子功能均為與核酸或者蛋白質(zhì)結(jié)合；行細(xì)胞組分功能集分析，發(fā)現(xiàn)兩組中差異蛋白主要位于細(xì)胞囊泡和細(xì)胞膜上。運(yùn)用 String 研究重復(fù)差異蛋白質(zhì)之間是否具有相互作用關(guān)系，從而繪制了作用絡(luò)圖，如圖 5 和圖 6。從圖中可以看出這些蛋白質(zhì)處于一個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，相互之間有聯(lián)系說明當(dāng)某個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)生改變時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致其他蛋白質(zhì)的表達(dá)水平發(fā)生變化在疾病的發(fā)生、發(fā)展中有著密切聯(lián)系。

黏著斑信號(hào)通路

KEGG-pathway分析

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Guang-shuai Li;Qing-feng Li;Ming-min Dong;Tao Zan;Shuang Ding;Lin-bo Liu;;Complement components of nerve regeneration conditioned fluid influence the microenvironment of nerve regeneration[J];Neural Regeneration Research;2016年04期

本文編號(hào)：2784303