【摘要】：腦膜瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一,其發(fā)病率約占顱內(nèi)所有原發(fā)腫瘤的15-25%。根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的最新病理分級,腦膜瘤可分為WHO Ⅰ、WHO Ⅱ和WHO Ⅲ三個級別。其中WHO Ⅱ和WHO Ⅲ級腦膜瘤較WHO Ⅰ級增殖活躍,復(fù)發(fā)率高且預(yù)后不佳。手術(shù)治療是針對高級別腦膜瘤首選的治療方式,但是影響其復(fù)發(fā)的因素及后續(xù)的治療選擇也較低級別腦膜瘤更加復(fù)雜。在過去的幾十年中,外科技術(shù)、放射治療技術(shù)、藥物治療方面都取得了很多進步,高級別腦膜瘤的整體生存率也略有改善,但是,仍然需要更多的前瞻性數(shù)據(jù)。目前,世界上有大量的基于微創(chuàng)技術(shù)和分子靶向治療技術(shù)發(fā)展的臨床試驗,試圖獲取治療高級別腦膜瘤的新的突破,因此,深入研究惡性腦膜瘤增殖失控的具體機制,尋找影響腦膜瘤發(fā)生發(fā)展的可靠的關(guān)鍵靶標(biāo)就顯得更加迫切,這些研究都將為后續(xù)臨床干預(yù)腦膜瘤提供理論和實驗支撐。視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白質(zhì)結(jié)合的鋅指蛋白1 (RIZ1)定位于1p36,目前被認為是一種重要的抑癌基因。最近的研究表明,該基因在膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。我們前期研究中發(fā)現(xiàn),RIZ1基因蛋白水平與腦膜瘤的病理分級呈負相關(guān),而在惡性腦膜瘤細胞系IOMM-Lee中過表達RIZ1可抑制細胞的增殖并使細胞發(fā)生G2/M期阻滯,并且能夠進一步促進細胞凋亡。更深入的研究表明,過表達RIZ1能降低c-Myc的表達。UbcH10是泛素結(jié)合酶家族的重要成員,其異常高表達具有致癌作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn),UbcH10在腦膜瘤組織中的表達與腦膜瘤的病理分級正相關(guān),且高表達的UbcH10提示了更差的預(yù)后。另外還發(fā)現(xiàn)c-Myc的過度表達可促進UbcH10的表達。因此,我們推測,RIZ1是否通過c-Myc調(diào)控UbcH10使腦膜瘤保持惡性增殖,而這其中的具體機制尚不了解。本實驗首先從手術(shù)切除的新鮮腦膜瘤組織標(biāo)本中培養(yǎng)并鑒定了 2株間變性(WHO Ⅲ級)腦膜瘤原代細胞,通過免疫組化和過表達實驗探討了 RIZ1和UbcH10的上下游關(guān)系,然后通過體外細胞實驗,觀察了 UbcH10在惡性腦膜瘤細胞中的生物學(xué)功能。最后,通過染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灻鞔_RIZ1依賴c-Myc調(diào)控UbcH10的具體機制。本研究共分為四個部分。第一部分:惡性腦膜瘤原代細胞的培養(yǎng)和鑒定;第二部分:RIZ1和UbcH10上下游關(guān)系的研究;第三部分:敲低UbcH10的表達對惡性腦膜瘤原代細胞功能的影響;第四部分:RIZ1通過c-Myc調(diào)控UbcH10的機制研究。第一部分惡性腦膜瘤原代細胞的培養(yǎng)和鑒定目的:培養(yǎng)惡性腦膜瘤原代細胞,為后續(xù)實驗提供體外實驗載體。方法:通過手術(shù)獲取新鮮人腦膜瘤組織標(biāo)本,利用化學(xué)消化法進行原代細胞的培養(yǎng)。通過細胞免疫熒光實驗對所獲取細胞進行腦膜瘤細胞特異性分子標(biāo)記物鑒定。最后行裸鼠成瘤實驗,觀察惡性腦膜瘤原代細胞的致瘤能力,獲取移植瘤標(biāo)本后再次行標(biāo)記物免疫組織化學(xué)分析。結(jié)果:培養(yǎng)并鑒定了兩株間變性腦膜瘤(WHO Ⅲ級)原代細胞,細胞在顯微鏡下呈現(xiàn)雙極或多極形態(tài),生長旺盛,均已進行超過50次的細胞傳代。兩株惡性腦膜瘤細胞行免疫熒光實驗提示上皮膜抗原(EMA)和波形蛋白(VIM)均陽性,裸鼠成瘤實驗獲取移植瘤行免疫組織化學(xué)分析EMA和VIM表達陽性,Ki-67比例分別高達40%和33%。另外,為進行對照實驗,同樣方法培養(yǎng)并鑒定出兩株WHO Ⅰ級腦膜瘤原代細胞。WHO Ⅰ級腦膜瘤細胞傳至第10代左右后細胞體積逐漸增大,增殖速率減緩。結(jié)論:經(jīng)原代細胞培養(yǎng)和鑒定,我們獲取了 2株WHO Ⅲ級和2株WHO Ⅰ級的人腦膜瘤原代細胞用于后續(xù)實驗。第二部分RIZ1和UbcH10上下游關(guān)系的研究目的:明確UbcH10為RIZ1的下游分子。方法:通過蛋白印跡法檢測4株腦膜瘤原代細胞中RIZ1和UbcH10的表達情況。構(gòu)建針對RIZ1的過表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染兩株WHO Ⅲ級腦膜瘤原代細胞,觀察UbcH10表達水平變化。最后通過免疫組織化學(xué)技術(shù)分析52例不同病理級別腦膜瘤組織標(biāo)本中RIZ1和UbcH10的表達情況,并統(tǒng)計學(xué)分析兩者的表達量有無相關(guān)性。結(jié)果:RIZ1在WHO Ⅰ級腦膜瘤原代細胞中高表達,在2株WHO Ⅲ級腦膜瘤原代細胞中表達較低,而UbcH10在WHO Ⅰ級腦膜瘤原代細胞中表達較低,在WHOⅢ級腦膜瘤原代細胞中表達較高。在2株WHO Ⅲ級腦膜瘤原代細胞中過表達RIZ1后,均檢測到UbcH10的表達水平降低。52例不同級別腦膜瘤標(biāo)本行免疫組織化學(xué)分析后發(fā)現(xiàn),RIZ1的表達同腦膜瘤級別負相關(guān),而UbcH10相反,同時兩者的表達量負相關(guān)(P0.0001)。結(jié)論:UbcH10為RIZ1的下游分子。第三部分下調(diào)UbcH10對腦膜瘤原代細胞生物學(xué)行為影響的研究目的:初步研究UbcH10在腦膜瘤原代細胞中的生物學(xué)功能。方法:首先通過血清饑餓法將細胞同步化于G0/G1期,隨后釋放細胞,在此后的不同時間點檢測UbcH10及細胞周期蛋白CyclinA2的表達變化。其次,設(shè)計合成針對UbcH10的siRNA干擾序列,轉(zhuǎn)染至2株惡性腦膜瘤原代細胞中,qRT-PCR和蛋白印跡檢測干擾效率。在UbcH10-siRNA轉(zhuǎn)染腦膜瘤原代細胞24h后行一系列細胞功能學(xué)實驗,檢測敲低UbcH10在惡性腦膜瘤原代細胞中的表達后對細胞增殖、周期、遷移、侵襲、凋亡的影響。結(jié)果:UbcH10在細胞周期各期表達不同,在G0/G1期表達最低。所設(shè)計siRNA轉(zhuǎn)染惡性腦膜瘤原代細胞后分別在mRNA和蛋白水平檢測到UbcH10的表達顯著下降。轉(zhuǎn)染UbcH10-siRNA后,細胞增殖實驗顯示腦膜瘤原代細胞增殖能力顯著下降,細胞周期實驗提示細胞發(fā)生G2/M期阻滯,遷移和侵襲實驗提示細胞運動能力下降,細胞凋亡實驗提示腦膜瘤原代細胞凋亡比率增加,并引起相關(guān)凋亡蛋白表達變化。結(jié)論:UbcH10具有明顯的細胞周期相關(guān)性,且在惡性腦膜瘤的進展中起著影響增殖、遷移、侵襲、凋亡等作用,是腦膜瘤細胞中潛在的致癌基因。第四部分RIZ1通過c-Myc調(diào)控UbcH10的機制研究目的:在細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面研究RIZ1通過c-Myc調(diào)控UbcH10的分子機制。方法:染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗檢測c-Myc是否與UbcH10啟動子結(jié)合。構(gòu)建c-Myc在UbcH10啟動子上結(jié)合位點的突變質(zhì)粒,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治鯮IZ1調(diào)控下游蛋白UbcH10是否依賴c-Myc。設(shè)計并構(gòu)建針對c-Myc的RNA干擾慢病毒,并轉(zhuǎn)染W(wǎng)HO Ⅲ級腦膜瘤原代細胞,在不同c-Myc背景下的惡性腦膜瘤原代細胞中分別轉(zhuǎn)染RIZ1過表達質(zhì)粒,檢測UbcH10的表達變化情況。結(jié)果:ChIP實驗提示c-Myc在UbcH10啟動子序列上有兩個穩(wěn)定的結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炋崾綬IZ1需依靠c-Myc調(diào)控UbcH10的啟動子活性。設(shè)計并構(gòu)建合成了針對c-Myc的RNA干擾慢病毒,經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后得到穩(wěn)定敲低c-Myc表達的WHO Ⅲ級腦膜瘤原代細胞。通過在不同c-Myc背景下原代細胞中轉(zhuǎn)染RIZ1過表達質(zhì)粒,在野生型細胞和c-Myc穩(wěn)定敲低細胞中比較UbcH10表達的下降程度發(fā)現(xiàn)差異明顯,有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:RIZ1通過c-Myc調(diào)控UbcH10的表達。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.45
【圖文】：

圖１．１邋４株人腦膜瘤原代細胞來源患者的影像學(xué)表現(xiàn)逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｉｍａｇｉｎｇ邋ａｐｐｅａｒａｎｃｅｓ邋ｏｆ邋ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ邋ｏｆ邋４邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ邋ｃｅｌｌｓ逡逑（Ｍｌ、Ｍ２來源于ＷＨＯ邋ＩＩＩ級間變性腦膜瘤，Ｍ３、Ｍ４來源于ＷＨＯ邋Ｉ級腦膜瘤，增逡逑強ＭＲＩ提示惡性腦膜瘤呈侵襲生長，且瘤內(nèi)信號不均，部分呈分葉狀，腫瘤邊緣不逡逑規(guī)則。）逡逑邐表１．１腦膜瘤原代細胞來源標(biāo)本臨床詳細資料邐逡逑住院號邋性別邐年齡邐病理診斷邐ＷＨＯ分級逡逑￣Ｍ＼邐５４０８５５邐＾邐４６邐間變性腦膜瘤邐ｎＦ逡逑Ｍ２邐５９７３３４邐男邐５８邐間變性腦膜瘤邐ＩＩＩ逡逑Ｍ３邐６１８７８７邐女邐５８邐腦膜皮型腦膜瘤邐Ｉ逡逑Ｍ４邐６３１５４９邐男邐６０邐腦膜皮型腦膜瘤邐Ｉ逡逑（二）主要實驗藥品及試劑逡逑高糖ＤＭＥＭ邐（加拿大ｗｉｓｅｎｔ公司）逡逑

二、腦膜瘤原代細胞特異性標(biāo)記物免疫熒光檢測結(jié)果逡逑原代腦膜瘤原代細胞經(jīng)培養(yǎng)傳代后，于第４代行細胞免疫熒光染色，４組細胞胞逡逑質(zhì)ＥＭＡ與ＶＩＭ表達均為陽性（圖１．３）。逡逑Ｍ１（ＷＨ０邋ＩＩＩ）邋Ｍ２（ＷＨ０邋ＩＩＩ）邋Ｍ３（ＷＨ０邋Ｉ邋）邋Ｍ４（ＷＨ０邋Ｉ邋）逡逑ＢＤＢＨ逡逑ａｎａ逡逑－１７邋－逡逑

逡逑圖１．３邋４株腦膜瘤原代細胞行細胞免疫熒光染色結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋４邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ邋ｃｅｌｌｓ逡逑（細胞免疫熒光實驗結(jié)果提示４株腦膜瘤原代細胞中ＥＭＡ和ＶＩＭ染色陽性，圖中逡逑綠色熒光提示ＥＭＡ和ＶＭ在細胞質(zhì)中表達，陽性染色率超過９０％，藍色熒光為細逡逑胞核經(jīng)Ｈｏｅｃｈｓｔ染色后表現(xiàn)，白色標(biāo)尺＝２５ｇｍ。）逡逑三、腦膜瘤原代細胞裸鼠成瘤及移植瘤免疫組化結(jié)果逡逑對Ｍｌ邋（ＷＨＯ邋ＩＩＩ）和Ｍ２邋（ＷＨＯ邋ＩＩＩ）邋２株ＷＨＯ邋ＩＩＩ級腦膜瘤原代細胞進行裸鼠逡逑成瘤實驗，觀察其致瘤能力，接種２株細胞的雄性裸鼠均順利成瘤，對所獲取移植瘤逡逑行免疫組織化學(xué)分析，ＥＭＡ與ＶＭ均染色陽性，Ｋｉ－６７指數(shù)分別高達４０％和３３％（圖逡逑１．４）。逡逑ＥＭＡ邐ＶＩＭ邐Ｋｉ－６７逡逑＇邋＿１邋．．逡逑Ｍ１邐．：偷．，ｉ邋．逡逑一逡逑Ｍ２邋？邐Ｖ邋：逡逑．—■．邐—邐W■—逡逑圖１．４裸鼠移植瘤免疫組織化學(xué)染色逡逑Ｆｉｇ．邋１．４邋Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ邋ｉｎ邋ｎｕｄｅ邋ｍｉｃｅ逡逑（分別對Ｍｌ和Ｍ２細胞行裸鼠成瘤實驗，獲取移植瘤行免疫組織化學(xué)分析，ＥＭＡ逡逑和Ｖ１Ｍ均染色陽性

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1 吳南寧,梁樹立,彭林,漆松濤;惡性腦膜瘤的治療及預(yù)后(附3例報告)[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2000年01期

2 公茂青,王運杰,吳杰;良惡性腦膜瘤T淋巴細胞Ag-NORs表達活性的研究[J];中華神經(jīng)外科雜志;2001年06期

3 孫金龍,于華強,魏麟,龐琦,張慶林,鮑秀峰,孫煒;惡性腦膜瘤的臨床診斷及治療[J];山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2002年02期

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5 張龍,梅良奎,汪新華,宋蓮淑;惡性腦膜瘤顱外轉(zhuǎn)移一例[J];中華神經(jīng)外科雜志;2003年04期

6 王

本文編號：2783581