【摘要】：工作目的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是成人常見的原發(fā)性高度惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(WHO Ⅳ級),即使聯(lián)合使用當(dāng)前最先進(jìn)的治療手段,其預(yù)后仍然很不樂觀。當(dāng)前迫切需要繼續(xù)在細(xì)胞和分子生物學(xué)水平上對GBM進(jìn)行深入的研究以取得突破。炎癥反應(yīng)能改變腫瘤微環(huán)境,通過多種活性因子促進(jìn)腫瘤的血管生成、細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。有研究認(rèn)為,成人大腦的室管膜下區(qū)(SVZ)因臨近側(cè)腦室受到腦脊液中炎癥誘導(dǎo)因子的影響而存在持續(xù)的炎癥反應(yīng),存在于SVZ的神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞在炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的多種活性因子(包括多種生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子)的持續(xù)刺激下會轉(zhuǎn)變成具有致瘤能力的腫瘤干細(xì)胞,而這些腫瘤干細(xì)胞可能是導(dǎo)致包括GBM在內(nèi)的腦部腫瘤的根源。因此,抑制炎癥反應(yīng)或許不僅可以從根源上遏止GBM的發(fā)生,還能通過抑制腫瘤血管生成和細(xì)胞增殖抑制GBM的發(fā)展。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在包括GBM在內(nèi)的很多惡性腫瘤中都呈異常表達(dá),與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移以及惡性進(jìn)展等密切相關(guān)。調(diào)控炎癥反應(yīng)和lncRNA都會對腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。本研究的目的在于,分析炎癥抑制劑對lncRNA及相關(guān)基因表達(dá)譜的改變,探索抑制炎癥反應(yīng)和調(diào)控相關(guān)lncRNA對GBM的影響和機(jī)制。研究方法1.使用Arraystar人類LncRNA芯片V3.0芯片對樣品進(jìn)行微陣列基因芯片檢測分析。使用 Agilent DNA Microarray Scanner(part number G2505C)進(jìn)行芯片掃描,使用Agilent Feature Extraction軟件(v11.0.1.1)采集芯片探針信號值,使用Agilent GeneSpring GX v12.1軟件進(jìn)行芯片標(biāo)準(zhǔn)化、挑選差異表達(dá)的lncRNA 和 mRNA。2.設(shè)計并合成針對HMMR和HMMR-AS1的siRNA或者構(gòu)建搭載HMMR和HMMR-AS1的shRNA的慢病毒載體,分別對細(xì)胞進(jìn)行瞬時或者穩(wěn)定轉(zhuǎn)染下調(diào)HMMR和HMMR-AS1表達(dá);合成HMMR和HMMR-AS 1全長序列,構(gòu)建慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞,使HMMR和HMMR-AS1過表達(dá)。3.使用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測細(xì)胞增殖或者細(xì)胞存活情況。4.使用transwell小室(8μm孔徑)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力。5.用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期情況。6.利用Applied Biosystems公司的TaqmanTM檢測試劑盒,在AB17300系統(tǒng)上完成實時定量PCR檢測,用于評估相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。7.使用免疫印記實驗或細(xì)胞免疫熒光實驗檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)情況。8.構(gòu)建裸小鼠GBM顱內(nèi)移植瘤模型或者裸小鼠GBM皮下移植瘤模型,從體內(nèi)水平觀察GBM生長情況。9.用免疫組織化學(xué)染色評估裸小鼠移植瘤組織的相關(guān)蛋白表達(dá)情況。10.使用 SPSS、GraphPad Prism、Microsoft Excel 和 ImageJ 等軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果1.炎癥抑制劑t-AUCB(sEH特異性抑制劑)導(dǎo)致U87細(xì)胞605個lncRNA和689個mRNA的表達(dá)出現(xiàn)了明顯變化(Fold Change≥2.0,P0.05),其中375個lncRNA和338個mRNA表達(dá)上調(diào),230個lncRNA和351個mRNA表達(dá)下調(diào)。2.t-AUCB所致差異表達(dá)的反義lncRNA中HMMR-AS1的下調(diào)幅度最大(Fold Change=6.47,P=0.031),其正義轉(zhuǎn)錄本HMMR mRNA也顯著下調(diào)。3.HMMR-AS1在GBM腫瘤組織和細(xì)胞系中都呈高表達(dá)。4.下調(diào)HMMR-AS1能導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期阻滯、抑制細(xì)胞遷移和侵襲。5.體外和體內(nèi)研究結(jié)果都顯示,下調(diào)HMMR-AS1后GBM細(xì)胞中HMMR表達(dá)水平降低、GBM細(xì)胞生長受抑制。6.下調(diào)HMMR-AS1能使GBM對X射線的放射治療更敏感。7.上調(diào)HMMR-AS 1使c-Myc水平升高但不影響HMMR的表達(dá)。8.HMMR-AS1可以維持HMMR mRNA的穩(wěn)定性。9.體外和體內(nèi)研究結(jié)果都顯示,上調(diào)HMMR-AS1能促進(jìn)GBM生長。10.因GBM通過上調(diào)COX-2抵抗t-AUCB,導(dǎo)致在體內(nèi)水平t-AUCB對GBM抑制效果不佳,所以用COX-2/sEH雙靶點(diǎn)抑制劑PTUPB替換t-AUCB繼續(xù)研究。在體外水平,PTUPB顯著抑制GBM細(xì)胞增殖、導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期阻滯、下調(diào)HMMR-AS1和HMMR的表達(dá)水平、抑制干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)、下調(diào)磷酸化EGFR的水平。11.體內(nèi)水平研究證實,PTUPB抑制GBM血管生成和腫瘤生長、抑制HMMR表達(dá)。12.一些對GBM生長有促進(jìn)作用的調(diào)控因子,例如HMMR、ERK1/2、c-Myc、CDK2、CDK4、BMIl、CyclinD1 和 ZEB1 受到了 PTUPB 和 HMMR-AS1 的共同調(diào)控。結(jié)論1.下調(diào)HMMR-AS1不僅能抑制GBM腫瘤生長、遷移和侵襲,還能增強(qiáng)GBM對放射線的敏感性;上調(diào)HMMR-AS1通過調(diào)控癌基因c-Myc的表達(dá)促進(jìn)GBM腫瘤的生長。這為以lncRNA作為靶點(diǎn)治療GBM提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。2.PTUPB對GBM具有顯著抑制作用,并且可以特異性抑制COX-2和sEH兩個靶點(diǎn),或?qū)榕R床上進(jìn)行GBM靶向治療提供新的思路。3.一些對GBM生長有促進(jìn)作用的蛋白受到了 PTUPB和HMMR-AS1的共同調(diào)控,說明炎癥反應(yīng)和lncRNA之間的相互作用對GBM的發(fā)生發(fā)展具有重要影響,對兩者之間的復(fù)雜聯(lián)系進(jìn)行深入探索,或?qū)镚BM的分子生物學(xué)診斷和靶向治療提供很有價值的線索。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.4
【圖文】：

圖１．３：反義方向上的轉(zhuǎn)錄事件發(fā)生時，與正義方向上ｍＲＮＡ的轉(zhuǎn)錄發(fā)生沖突、抑制正義逡逑

圖１．５：細(xì)胞核內(nèi)的ｉｌ：義－反義ＲＮＡ互補(bǔ)形成雙鏈ＲＮＡ，圖片引向參考文獻(xiàn)［２３］逡逑

圖１．６：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)正義－反義雙鏈ＲＮＡ的形成，圖片引自參考文獻(xiàn)［２３］

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本文編號：2783176