【摘要】：目的:視黃酸誘導(dǎo)14基因(Retinoic αcid-induced 14,RAI14)是由視黃酸誘導(dǎo)的發(fā)育調(diào)節(jié)基因,與NIK/NF-κB信號傳導(dǎo)密切相關(guān)。在本研究中,我們檢測在炎癥因子和化學(xué)缺血刺激下,RAI14通過mTOR信號調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)炎癥的分子機(jī)制。方法:(1)PBS(對照)、LPS(50,100和200 ng/mL)或TNF-α(5,10,20和50 ng/mL)分別刺激U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞6、12、24或48小時,采用RT-qPCR和免疫印跡檢測LPS或TNF-α刺激不同時間RAI14 mRNA和蛋白水平變化。(2)將siR-RAI14(實驗組)或siR-GAPDH(陽性對照組)采用Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑(空白對照)轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞,RT-qPCR測量前炎癥因子IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平。(3)免疫熒光研究敲低RAI14基因?qū)87細(xì)胞中NF-κKBp65活化的潛在影響。雙熒光素酶測定法評價NF-κB的活性。應(yīng)用Co-IP實驗技術(shù)檢測內(nèi)源性RAI14與NF-κBp65之間的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)。(4)采用依維莫司(20nM)預(yù)處理之后,將U87細(xì)胞暴露于LPS(200ng/mL)6小時或TNF-α(20ng/mL)48小時,免疫印跡分析RAI14蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用RT-qPCR測定依維莫司(20nM)預(yù)處理對LPS刺激U87細(xì)胞后RAI14和炎性細(xì)胞因子的mRNA水平變化。免疫熒光分析依維莫司(20nM)處理24小時后,U87細(xì)胞中p-mTOR和p-eIF4EBP的蛋白磷酸化水平。(5)在RAI14小干擾RNA瞬時轉(zhuǎn)染6小時之后,采用LPS(200ng/mL)處理U87細(xì)胞6小時。應(yīng)用RT-qPCR定量評價前炎癥細(xì)胞因子IL-1β,IL-6和TNF-α的mRNA水平。瞬時轉(zhuǎn)染小干擾RNA之后,將U87細(xì)胞暴露于LPS(200ng/mL)6小時或TNF-α(20ng/mL)48小時,經(jīng)依維莫司(20nM)治療24小時,采用免疫印跡分析p-IKK α/β(Ser176/180)和NF-κB p65蛋白的水平。(6)采用50、100、300或500 uM CoC12溫育24小時后,裂解U87細(xì)胞采用免疫印跡檢測RAI14蛋白表達(dá)水平。RT-QPCR實驗分析CoCl2對U87細(xì)胞中IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)的影響。(7)U87細(xì)胞暴露于TNF-α(20ng/mL)48小時后,給予青蒿素(20uM)治療12小時,免疫印跡分析RAI14蛋白表達(dá)水平。在敲低RAI14基因后,采用TNF-α(20ng/mL)處理U87細(xì)胞48小時。RT-qPCR檢測促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的mRNA水平。結(jié)果:(1)促炎激動劑能以時間和劑量依賴方式導(dǎo)致RAI14的mRNA水平升高。與TNF-α處理的U87細(xì)胞相比,LPS引起的效果更顯著。(2)RAI14基因敲低顯著下調(diào)RAI14mRNA和蛋白表達(dá)水平。與對照組相比,20ng/mL TNF-α能顯著促進(jìn)炎癥反應(yīng)。敲低RAI14基因能減弱TNF-α誘導(dǎo)的U87膠質(zhì)炎癥。(3)RAI14活性抑制能阻斷NF-κBp65啟動子熒光素酶活性,且siR-RAI14處理明顯降低細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65水平。雖然RAI14能與NF-κBp65在胞核和胞質(zhì)部分共定位,但Co-IP未檢測到內(nèi)源性RAI14和NF-κBp65之間的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)。(4)依維莫司(mTOR抑制劑)處理顯著降低RAI14蛋白的表達(dá),但未觀察到其對RAI14 mRNA水平的顯著差異。依維莫司也抑制IL-1β、IL-6 mRNA和mTOR的蛋白磷酸化水平,并且增加eIF4EBP1的蛋白磷酸化水平。(5)siR-RAI14轉(zhuǎn)染能誘導(dǎo)IL-1β,IL-6和TNF-α以低于對照組mRNA水平表達(dá)。同時,siR-RAI14轉(zhuǎn)染不僅增強mTOR抑制劑對NF-κBp65負(fù)性調(diào)節(jié)作用,而且顯著性促進(jìn)依維莫司依賴的p-IKKα/β下調(diào)。(6)50uM CoC12能導(dǎo)致RAI14蛋白表達(dá)降低。給予300或500 uM CoCl2處理U87細(xì)胞反而上調(diào)了RA114蛋白表達(dá)水平。與該觀察結(jié)果一致,高劑量CoCl2對IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)的作用同時在U87細(xì)胞中表現(xiàn)出類似的效應(yīng)。此外,也觀察到依維莫司能作為NF-κBp65的有效負(fù)性調(diào)節(jié)劑,能在siR-RAI14轉(zhuǎn)染實驗中進(jìn)一步減弱炎癥效應(yīng)。(7)給予青蒿素處理U87細(xì)胞能顯著降低RAI14蛋白的表達(dá),并抑制IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)水平。而siR-RAI14轉(zhuǎn)染進(jìn)一步增強這種抑制作用。結(jié)論:RAI14通過mTOR信號增強NF-κ B活化及其相關(guān)炎癥效應(yīng)。促炎激動劑,尤其是LPS,能上調(diào)RAI14介導(dǎo)的功能。在LPS和TNF-α刺激的U87細(xì)胞炎癥模型當(dāng)中,RAI14能正向調(diào)節(jié)前炎細(xì)胞因子的表達(dá)。RAI14還通過調(diào)控NF-κB信號傳導(dǎo),參與前炎細(xì)胞因子的生物學(xué)效應(yīng)。另外,mTOR/eIF4EBPl信號通路參與星形膠質(zhì)細(xì)胞RAI14轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)節(jié)。其中mTOR活性可能是RAI14介導(dǎo)的NF-κ B信號途徑的正向強效調(diào)節(jié)因子。上述研究為RAI 14在炎癥應(yīng)激和化學(xué)缺氧刺激環(huán)境下,通過mTOR信號調(diào)控NF-κ B膠質(zhì)炎癥效應(yīng)提出了新的見解,也識別傳統(tǒng)中藥單體青蒿素對該炎癥效應(yīng)及信號分子的潛在藥物功效。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R741
【圖文】：

此表明兩者可能具相似功能。為了闡明上述假設(shè)，在Ｕ８７細(xì)胞中進(jìn)行ｓｉＲ－ＲＡＩ１４瞬逡逑時轉(zhuǎn)染實驗。敲低ＲＡＩ１４基因能夠顯著降低ＲＡＩ１４蛋白和ｍＲＮＡ水平（分別為３８．１％和逡逑３８．７％）（圖２－２，邋ａ－ｄ）。為了量化ＴＮＦ－ａ處理Ｕ８７細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子ｍＲＮＡ表達(dá)水平，逡逑采用ＲＴ－ｑＰＣＲ測量ＩＬ－ｉｐ和ＩＬ－６邋ｍＲＮＡ表達(dá)水平。與對照組相比，預(yù)定劑量的２０ｎｇ／逡逑ｍＬ邋ＴＮＦ－ａ顯示出顯著地促炎癥效應(yīng)（圖２－２ｅ，ｆ）。尤其在ＴＮＦ－ａ處理Ｕ８７細(xì)胞４８小時后逡逑觀察到ＩＬ＿１（３的最高表達(dá)水平（２６７．２％），同時ＩＬ－６邋ｍＲＮＡ的水平也顯著地升高（１９９．７％）。逡逑然而

此表明兩者可能具相似功能。為了闡明上述假設(shè)，在Ｕ８７細(xì)胞中進(jìn)行ｓｉＲ－ＲＡＩ１４瞬逡逑時轉(zhuǎn)染實驗。敲低ＲＡＩ１４基因能夠顯著降低ＲＡＩ１４蛋白和ｍＲＮＡ水平（分別為３８．１％和逡逑３８．７％）（圖２－２，邋ａ－ｄ）。為了量化ＴＮＦ－ａ處理Ｕ８７細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子ｍＲＮＡ表達(dá)水平，逡逑采用ＲＴ－ｑＰＣＲ測量ＩＬ－ｉｐ和ＩＬ－６邋ｍＲＮＡ表達(dá)水平。與對照組相比，預(yù)定劑量的２０ｎｇ／逡逑ｍＬ邋ＴＮＦ－ａ顯示出顯著地促炎癥效應(yīng)（圖２－２ｅ，ｆ）。尤其在ＴＮＦ－ａ處理Ｕ８７細(xì)胞４８小時后逡逑觀察到ＩＬ＿１（３的最高表達(dá)水平（２６７．２％），同時ＩＬ－６邋ｍＲＮＡ的水平也顯著地升高（１９９．７％）。逡逑然而

４．２敲低ＲＡＩ１４基因減弱促炎激動劑誘導(dǎo)的ＮＦ－邋ｋ邋Ｂ活化逡逑通過基因本體論的預(yù)測分析，ＲＡＩ１４被認(rèn)為與ＮＩＫ／ＮＦ－ｋＢ信號傳導(dǎo)相關(guān)［７］。這與實驗逡逑中Ｓ１Ｒ－ＲＡＩ１４介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)現(xiàn)象是一致的（圖２－２ｇ，ｈ）。為了探索ＲＡ１１４調(diào)節(jié)逡逑促炎細(xì)胞因子的精確分子機(jī)制，Ｕ８７細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染ｓｉＲ－ＲＡＩ１４后，采用免疫熒光分析逡逑ＮＦ－ｋＢＰ６５活化反應(yīng)。與對照相比，ＴＮＦ－ｏｔ刺激的Ｕ８７細(xì)胞胞核中ＮＦ－ｋＢＰ６５熒光強度增逡逑加（圖２－４ａ）。此外，與相應(yīng)的ｓｉＲ－ＮＣ相比，Ｓ１Ｒ－ＲＡＩ１４瞬時轉(zhuǎn)染后可降低Ｕ８７細(xì)胞胞核逡逑中ＮＦ－ｋＢＰ６５熒光強度（圖２－４ｂ），此結(jié)果表明ＲＡＩ１４可促進(jìn)ＮＦ－ｋＢＰ６５的核積累。值得一逡逑提的是，采用納米顆粒轉(zhuǎn)染試劑瞬時轉(zhuǎn)染ｓｉＲＮＡ邋（圖２－３）后，轉(zhuǎn)染試劑本身對ＮＦ－ｋＢＰ６５逡逑活化和核轉(zhuǎn)位顯示出抑制效應(yīng)。雖然發(fā)現(xiàn)ＲＡＩ１４與ＮＦ－ｋＢＰ６５在胞核和胞質(zhì)中部分共定位逡逑（圖２－４ｂ），但是Ｃｏ－ＩＰ實驗并未檢測到內(nèi)源性ＲＡＩ１４和ＮＦ－ｋＢＰ６５之間的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)（圖２－４ｃ）逡逑［５７］。逡逑之前的研究預(yù)測出ＲＡＩ１４可作為人類基因組中預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子和輔因子［５ｆｉ］，我們接下逡逑來在表達(dá)由啟動子驅(qū)動的螢火蟲熒光素酶報告基因的Ｕ８７細(xì)胞中

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