【摘要】：目的本課題擬通過建立蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)大鼠模型,檢測建模后1h、6h、12h、24h、48h、72h神經(jīng)功能損害評分、腦水腫程度、海馬神經(jīng)元凋亡水平以及腦組織內(nèi)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)相關(guān)的表達因子CAAT增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)、海馬葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)和Caspase-12的表達,并與空白對照組和假手術(shù)組對照比較,來探討ER stress與SAH后早期腦損傷(EBI)的相關(guān)性及作用機制。材料和方法1.選取成年雄性SD大鼠78只,體質(zhì)量(300±50)g,采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為空白對照組6只、假手術(shù)組36只與SAH組36只。2.采用視交叉前池注血法建立SAH模型。大鼠穿刺點在冠狀縫前5mm、中線旁開3 mm處。假手術(shù)組注入生理鹽水0.3ml,SAH組注入自體動脈血0.3 ml。3.參照Kaoutzanis等的行為學(xué)評分進行神經(jīng)功能缺陷評分:觀察進食、運動反應(yīng)、睜眼反應(yīng)。總分11分,最低3分。對各組大鼠各時間點進行神經(jīng)行為學(xué)評分。4.組織固定及處理:斷頭法取腦,取下兩側(cè)海馬及額葉底部腦組織,用于檢測Caspase-12、CHOP、GRP78蛋白的表達、神經(jīng)元凋亡細胞水平,剩余腦組織用于干濕重測定評估腦水腫情況。5.TUNEL法檢測大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細胞。6.Western blot法檢測CHOP、GRP78、Caspase-12蛋白的定量表達。7.干濕稱重法計算腦組織標本水含量來反映腦水腫程度:計算公式為:腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。8.電鏡觀察細胞形態(tài),了解神經(jīng)元凋亡情況。9.統(tǒng)計學(xué)處理:實驗所得數(shù)據(jù)全部采用二因素方差分析,并利用LSD法進行多重比較。對于各個指標兩兩之間計算Pearson相關(guān)系數(shù),并進行顯著性測驗。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.建立SAH模型結(jié)果:SAH組建模中有1只大鼠因麻醉死亡,3只大鼠因注血后72h內(nèi)死亡,病死率11.11%;假手術(shù)組建模中有2只大鼠因麻醉死亡,1只大鼠注生理鹽水后72h內(nèi)死亡,病死率8.33%;空白對照組無死亡,病死率0;三組實驗死亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),及時補充7只大鼠繼續(xù)實驗。解剖取腦標本后空白對照組、假手術(shù)組無蛛網(wǎng)膜下腔出血或僅有少許蛛網(wǎng)膜下腔出血;SAH組大鼠取腦后在Willis環(huán)周圍可見明顯蛛網(wǎng)膜下腔積血,部分標本在視交叉池、環(huán)池、腳間池等腦池處可見較多血凝塊。2.神經(jīng)功能缺陷評分結(jié)果:(1)大鼠經(jīng)水合氯醛溶液腹腔麻醉后1h未完全清醒,無法進行神經(jīng)功能缺陷評分。一般3h后大鼠逐漸恢復(fù)清醒,故從6 h開始評分。(2)空白對照組、假手術(shù)組各時間點評分無明顯變化,接近滿分,兩組比較組內(nèi)、組間無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(3)SAH組評分6h開始下降,24h達到谷值,然后逐漸上升,第6h、12h、24h、48h、72hSAH組與空白對照組、假手術(shù)組比較明顯降低,組間比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(4)SAH組在24h時間點下降最為明顯,組內(nèi)與其他時間點比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3.腦水腫檢測:(1)空白對照組及假手術(shù)組腦水腫程度輕微,組間、組內(nèi)各時間點比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(2)SAH組6h腦水腫開始加重,24h達到峰值,48、72h腦水腫仍較重。第12、24、48、72h SAH組與空白對照組、假手術(shù)組比較腦水腫明顯,有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(3)SAH組在24h時間點水腫最嚴重,與1h、6h、12h、72h比較組內(nèi)有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),但與48h時間點比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡結(jié)果:(1)空白對照組、假手術(shù)組海馬神經(jīng)元凋亡不明顯,組間、組內(nèi)比較差異無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(2)SAH組神經(jīng)元凋亡較明顯,12h凋亡細胞明顯增多,24h凋亡細胞達到峰值,48 h凋亡細胞數(shù)目開始逐漸下降,72h凋亡細胞數(shù)目明顯減少,在6、12、24、48、72h SAH組與空白對照組、假手術(shù)組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),但在1h時間點SAH組與空白對照組、假手術(shù)組比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(3)SAH組組內(nèi)比較24h時間點凋亡最嚴重,與組內(nèi)其他時間點比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。5.Western blot檢測CHOP蛋白表達結(jié)果:(1)空白對照組、假手術(shù)組CHOP蛋白表達微弱,組間、組內(nèi)在不同時間點比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(2)SAH組CHOP蛋白表達與空白對照組、假手術(shù)組比較明顯增多,SAH組6h CHOP蛋白表達開始上升,于24h達到峰值,然后逐漸下降,72h仍有較明顯表達,第12、24、48、72hSAH組與對照組、假手術(shù)組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),但第1h、6h SAH組與對照組、假手術(shù)組比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(3)SAH組內(nèi)24h時間點CHOP蛋白表達最明顯,與組內(nèi)其他時間點比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。6.Western blot檢測GRP78蛋白表達結(jié)果:(1)空白對照組、假手術(shù)組GRP78蛋白均表達微弱,組間、組內(nèi)在不同時間點比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(2)SAH組GRP78蛋白表達較空白對照組、假手術(shù)組明顯增高,SAH后6h開始上升,于24 h達到峰值,然后逐漸下降,72 h表達仍較明顯,第12h、24h、48h、72h SAH組與空白對照組、假手術(shù)組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),但在第1h、6h SAH組與對照組、假手術(shù)組比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(3)SAH組內(nèi)24h時間點GRP78蛋白表達最明顯,與組內(nèi)其他時間點比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。7.Western blot檢測Caspase-12表達結(jié)果:(1)空白對照組、假手術(shù)組Caspase-12表達微弱,組間、組內(nèi)不同時間點比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(2)SAH組Caspase-12表達較空白對照組、假手術(shù)組明顯增高,SAH后6h開始明顯上升,于24h達到峰值,然后逐漸下降,72h仍有少量表達,第6h、12h、24h、48h、72h SAH組與空白對照組、假手術(shù)組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),第1h SAH組與對照組、假手術(shù)組比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(3)SAH組內(nèi)24h時間點表達最明顯,與組內(nèi)其他時間點比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。8.電鏡觀察結(jié)果:SAH組海馬神經(jīng)元凋亡比較嚴重,術(shù)后6h即可見細胞皺縮,體積變小,12h時胞質(zhì)內(nèi)空泡較多,細胞核體積變小,核膜下染色質(zhì)邊集、濃聚,呈現(xiàn)凋亡表現(xiàn),24h時最為嚴重,可見細胞核裂解,凋亡小體形成�？瞻讓φ战M及假手術(shù)組海馬神經(jīng)元及細胞器形態(tài)良好。9.根據(jù)Spearman相關(guān)性分析顯示,SAH組大鼠的CHOP、GRP78和Caspase-12蛋白表達結(jié)果與腦水腫嚴重程度及神經(jīng)元凋亡結(jié)果之間存在極顯著正相關(guān),與神經(jīng)功能缺陷評分存在極顯著負相關(guān)(P0.05)。其中在SAH后24h時間點表現(xiàn)最為明顯。結(jié)論本研究表明:(一)在SAH后72h內(nèi)CHOP、GRP78和Caspase-12表達均顯著增高,說明SAH后確實發(fā)生了ER stress。(二)通過分析空白對照組、假手術(shù)組、SAH組的神經(jīng)功能缺陷評分、腦水腫程度和神經(jīng)元凋亡的差異,以及電鏡下細胞及細胞器形態(tài),說明在SAH早期確實發(fā)生了EBI。(三)證實了CHOP、GRP78和Caspase-12表達與EBI嚴重程度之間均存在正相關(guān),初步揭示CHOP、GRP78和Caspase-12表達在SAH后EBI的病理過程中發(fā)揮了重要作用,其主要機制是SAH后過度激活的ER stress通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細胞凋亡(endoplasmic reticulum associated death,ERAD)途徑造成了的大腦皮層神經(jīng)元凋亡。(四)為今后深入研究SAH后EBI的發(fā)生機制及尋找針對性的治療策略、潛在治療靶點提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R743.35
【圖文】：

圖I空白對照組大鼠腦組織標本:蛛網(wǎng)膜下腔無出血

假手術(shù)組大鼠腦組織標本:29h時問點大鼠可有少

穿刺原因部分可見少許蛛網(wǎng)膜下腔出血，但無血凝塊（圖２）邋；邋ＳＡＨ組大鼠取腦后在Ｗｉｌｌ邋ｉｓ逡逑環(huán)周圍可見明顯蛛網(wǎng)膜下腔積血，部分標本在視交叉池、環(huán)池、腳間池等腦池處可見較多逡逑血凝塊（圖３）。逡逑圖１空白對照組大鼠腦組織標本：蛛網(wǎng)膜下腔無出血逡逑＿逡逑ｍｍ逡逑Ｍｍ逡逑圖２假手術(shù)組大鼠腦組織標本：２４ｈ時間點大鼠可有少許蛛網(wǎng)膜下腔出血。逡逑灥＿逡逑ＨＡ逡逑圖３邋ＳＡＨ組大鼠腦組織標本：ＳＡＨ組２４ｈ大鼠視交叉池環(huán)池等明顯蛛網(wǎng)膜下腔出血，部分形成血凝塊，逡逑嚴重者橋前池也可見明顯蛛網(wǎng)膜下腔出血。逡逑２．２神經(jīng)功能缺陷評分結(jié)果：逡逑（１）大鼠經(jīng)水合氯醛溶液腹腔麻醉后ｌｈ未完全清醒，無法進行神經(jīng)功能缺陷評分。一般逡逑３ｈ后大鼠逐漸恢復(fù)清醒，故從６邋ｈ開始評分。逡逑

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本文編號：2772721