【摘要】：目的本課題擬通過建立蛛網膜下腔出血(SAH)大鼠模型,檢測建模后1h、6h、12h、24h、48h、72h神經功能損害評分、腦水腫程度、海馬神經元凋亡水平以及腦組織內與內質網應激(ER stress)相關的表達因子CAAT增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)、海馬葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)和Caspase-12的表達,并與空白對照組和假手術組對照比較,來探討ER stress與SAH后早期腦損傷(EBI)的相關性及作用機制。材料和方法1.選取成年雄性SD大鼠78只,體質量(300±50)g,采用隨機數字表法將大鼠分為空白對照組6只、假手術組36只與SAH組36只。2.采用視交叉前池注血法建立SAH模型。大鼠穿刺點在冠狀縫前5mm、中線旁開3 mm處。假手術組注入生理鹽水0.3ml,SAH組注入自體動脈血0.3 ml。3.參照Kaoutzanis等的行為學評分進行神經功能缺陷評分:觀察進食、運動反應、睜眼反應�？偡�11分,最低3分。對各組大鼠各時間點進行神經行為學評分。4.組織固定及處理:斷頭法取腦,取下兩側海馬及額葉底部腦組織,用于檢測Caspase-12、CHOP、GRP78蛋白的表達、神經元凋亡細胞水平,剩余腦組織用于干濕重測定評估腦水腫情況。5.TUNEL法檢測大鼠海馬神經元凋亡細胞。6.Western blot法檢測CHOP、GRP78、Caspase-12蛋白的定量表達。7.干濕稱重法計算腦組織標本水含量來反映腦水腫程度:計算公式為:腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。8.電鏡觀察細胞形態(tài),了解神經元凋亡情況。9.統(tǒng)計學處理:實驗所得數據全部采用二因素方差分析,并利用LSD法進行多重比較。對于各個指標兩兩之間計算Pearson相關系數,并進行顯著性測驗。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.建立SAH模型結果:SAH組建模中有1只大鼠因麻醉死亡,3只大鼠因注血后72h內死亡,病死率11.11%;假手術組建模中有2只大鼠因麻醉死亡,1只大鼠注生理鹽水后72h內死亡,病死率8.33%;空白對照組無死亡,病死率0;三組實驗死亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),及時補充7只大鼠繼續(xù)實驗。解剖取腦標本后空白對照組、假手術組無蛛網膜下腔出血或僅有少許蛛網膜下腔出血;SAH組大鼠取腦后在Willis環(huán)周圍可見明顯蛛網膜下腔積血,部分標本在視交叉池、環(huán)池、腳間池等腦池處可見較多血凝塊。2.神經功能缺陷評分結果:(1)大鼠經水合氯醛溶液腹腔麻醉后1h未完全清醒,無法進行神經功能缺陷評分。一般3h后大鼠逐漸恢復清醒,故從6 h開始評分。(2)空白對照組、假手術組各時間點評分無明顯變化,接近滿分,兩組比較組內、組間無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。(3)SAH組評分6h開始下降,24h達到谷值,然后逐漸上升,第6h、12h、24h、48h、72hSAH組與空白對照組、假手術組比較明顯降低,組間比較有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。(4)SAH組在24h時間點下降最為明顯,組內與其他時間點比較有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。3.腦水腫檢測:(1)空白對照組及假手術組腦水腫程度輕微,組間、組內各時間點比較無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。(2)SAH組6h腦水腫開始加重,24h達到峰值,48、72h腦水腫仍較重。第12、24、48、72h SAH組與空白對照組、假手術組比較腦水腫明顯,有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。(3)SAH組在24h時間點水腫最嚴重,與1h、6h、12h、72h比較組內有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05),但與48h時間點比較無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.TUNEL法檢測神經元凋亡結果:(1)空白對照組、假手術組海馬神經元凋亡不明顯,組間、組內比較差異無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。(2)SAH組神經元凋亡較明顯,12h凋亡細胞明顯增多,24h凋亡細胞達到峰值,48 h凋亡細胞數目開始逐漸下降,72h凋亡細胞數目明顯減少,在6、12、24、48、72h SAH組與空白對照組、假手術組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05),但在1h時間點SAH組與空白對照組、假手術組比較無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。(3)SAH組組內比較24h時間點凋亡最嚴重,與組內其他時間點比較有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。5.Western blot檢測CHOP蛋白表達結果:(1)空白對照組、假手術組CHOP蛋白表達微弱,組間、組內在不同時間點比較無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。(2)SAH組CHOP蛋白表達與空白對照組、假手術組比較明顯增多,SAH組6h CHOP蛋白表達開始上升,于24h達到峰值,然后逐漸下降,72h仍有較明顯表達,第12、24、48、72hSAH組與對照組、假手術組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05),但第1h、6h SAH組與對照組、假手術組比較無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。(3)SAH組內24h時間點CHOP蛋白表達最明顯,與組內其他時間點比較有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。6.Western blot檢測GRP78蛋白表達結果:(1)空白對照組、假手術組GRP78蛋白均表達微弱,組間、組內在不同時間點比較無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。(2)SAH組GRP78蛋白表達較空白對照組、假手術組明顯增高,SAH后6h開始上升,于24 h達到峰值,然后逐漸下降,72 h表達仍較明顯,第12h、24h、48h、72h SAH組與空白對照組、假手術組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05),但在第1h、6h SAH組與對照組、假手術組比較無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。(3)SAH組內24h時間點GRP78蛋白表達最明顯,與組內其他時間點比較有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。7.Western blot檢測Caspase-12表達結果:(1)空白對照組、假手術組Caspase-12表達微弱,組間、組內不同時間點比較無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。(2)SAH組Caspase-12表達較空白對照組、假手術組明顯增高,SAH后6h開始明顯上升,于24h達到峰值,然后逐漸下降,72h仍有少量表達,第6h、12h、24h、48h、72h SAH組與空白對照組、假手術組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05),第1h SAH組與對照組、假手術組比較無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。(3)SAH組內24h時間點表達最明顯,與組內其他時間點比較有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。8.電鏡觀察結果:SAH組海馬神經元凋亡比較嚴重,術后6h即可見細胞皺縮,體積變小,12h時胞質內空泡較多,細胞核體積變小,核膜下染色質邊集、濃聚,呈現(xiàn)凋亡表現(xiàn),24h時最為嚴重,可見細胞核裂解,凋亡小體形成�？瞻讓φ战M及假手術組海馬神經元及細胞器形態(tài)良好。9.根據Spearman相關性分析顯示,SAH組大鼠的CHOP、GRP78和Caspase-12蛋白表達結果與腦水腫嚴重程度及神經元凋亡結果之間存在極顯著正相關,與神經功能缺陷評分存在極顯著負相關(P0.05)。其中在SAH后24h時間點表現(xiàn)最為明顯。結論本研究表明:(一)在SAH后72h內CHOP、GRP78和Caspase-12表達均顯著增高,說明SAH后確實發(fā)生了ER stress。(二)通過分析空白對照組、假手術組、SAH組的神經功能缺陷評分、腦水腫程度和神經元凋亡的差異,以及電鏡下細胞及細胞器形態(tài),說明在SAH早期確實發(fā)生了EBI。(三)證實了CHOP、GRP78和Caspase-12表達與EBI嚴重程度之間均存在正相關,初步揭示CHOP、GRP78和Caspase-12表達在SAH后EBI的病理過程中發(fā)揮了重要作用,其主要機制是SAH后過度激活的ER stress通過內質網相關性細胞凋亡(endoplasmic reticulum associated death,ERAD)途徑造成了的大腦皮層神經元凋亡。(四)為今后深入研究SAH后EBI的發(fā)生機制及尋找針對性的治療策略、潛在治療靶點提供了理論依據。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R743.35
【圖文】：

圖I空白對照組大鼠腦組織標本:蛛網膜下腔無出血

假手術組大鼠腦組織標本:29h時問點大鼠可有少

穿刺原因部分可見少許蛛網膜下腔出血，但無血凝塊（圖２）邋；邋ＳＡＨ組大鼠取腦后在Ｗｉｌｌ邋ｉｓ逡逑環(huán)周圍可見明顯蛛網膜下腔積血，部分標本在視交叉池、環(huán)池、腳間池等腦池處可見較多逡逑血凝塊（圖３）。逡逑圖１空白對照組大鼠腦組織標本：蛛網膜下腔無出血逡逑＿逡逑ｍｍ逡逑Ｍｍ逡逑圖２假手術組大鼠腦組織標本：２４ｈ時間點大鼠可有少許蛛網膜下腔出血。逡逑灥＿逡逑ＨＡ逡逑圖３邋ＳＡＨ組大鼠腦組織標本：ＳＡＨ組２４ｈ大鼠視交叉池環(huán)池等明顯蛛網膜下腔出血，部分形成血凝塊，逡逑嚴重者橋前池也可見明顯蛛網膜下腔出血。逡逑２．２神經功能缺陷評分結果：逡逑（１）大鼠經水合氯醛溶液腹腔麻醉后ｌｈ未完全清醒，無法進行神經功能缺陷評分。一般逡逑３ｈ后大鼠逐漸恢復清醒，故從６邋ｈ開始評分。逡逑

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