發(fā)布時間：2020-07-27 21:11

【摘要】：研究背景:周圍神經(jīng)損傷后軸突的再生和相應(yīng)靶器官功能的恢復(fù)仍是重要的臨床挑戰(zhàn)。損傷導(dǎo)致軸突崩解,雪旺細(xì)胞(Schwann cells,SCs)和巨噬細(xì)胞被激活重新參與到再生修復(fù)的過程中。隨著組織再生工程的不斷發(fā)展,越來越多的生物材料被用以修復(fù)周圍神經(jīng)損傷。角蛋白是一種廣泛存在于毛發(fā)、指甲和羽毛中的天然物質(zhì),具有氨基酸組成穩(wěn)定、可塑性強(qiáng)、生物相容性好、降解性好等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)報道,從羊毛或羽毛中提取的角蛋白能夠支持細(xì)胞的生長并促進(jìn)組織的再生。本研究采用還原法提取人發(fā)角蛋白(human hair keratin,HHK),并通過進(jìn)一步改變提取條件制備了人發(fā)角蛋白海綿(human hair keratin sponge,HHK sponge),分別應(yīng)用于體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。體外研究表明,HHK能促進(jìn)SCs的粘附、增殖、遷移和神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌,調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的表達(dá),促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)神經(jīng)元軸突的延伸。體內(nèi)將HHK海綿包裹于坐骨神經(jīng)擠壓傷部位可促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。此外,HHK海綿可在5周內(nèi)被機(jī)體分解和吸收,不僅為早期修復(fù)創(chuàng)造出一個合適的微環(huán)境,又不影響后期軸突的延伸。因此,HHK被認(rèn)為是一種能夠促進(jìn)神經(jīng)再生有前景的生物材料。研究目的:探討HHK作為一種新型組織工程生物材料,在體外調(diào)節(jié)SCs、巨噬細(xì)胞和DRG神經(jīng)元的生物學(xué)活性,在體內(nèi)促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后軸突的再生。研究方法:(1)HHK的提取和HHK海綿的制備。(2)通過計(jì)數(shù)分析、CCK-8實(shí)驗(yàn)、Transwell小室和劃痕實(shí)驗(yàn)以及RT-q PCR來觀察HHK對SCs黏附、增殖、遷移和營養(yǎng)因子表達(dá)的影響。(3)通過免疫熒光檢測HHK調(diào)節(jié)DRG神經(jīng)元軸突的延伸。(4)通過RT-q PCR檢測HHK對巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響。(5)建立體內(nèi)SD大鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷模型。(6)通過坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic nerve function index,SFI)、足印分析、腓腸肌濕重和肌纖維形態(tài)等指標(biāo)觀察HHK海綿對坐骨神經(jīng)損傷后相應(yīng)功能的改善情況。(7)通過透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)分析HHK海綿調(diào)節(jié)髓鞘再生的能力。研究結(jié)果:(1)經(jīng)還原法提取了HHK并制備HHK海綿。(2)HHK能夠促進(jìn)SCs黏附、增殖、遷移和神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)。(3)HHK能夠促進(jìn)DRG神經(jīng)元軸突的生長。(4)HHK能夠降低巨噬細(xì)胞中促炎因子IL-6、TNF-α、i-NOS、IL-1β的表達(dá),提高抑炎因子IL-10的表達(dá)。(5)HHK海綿在體內(nèi)加快了SD大鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷后神經(jīng)恢復(fù)。研究結(jié)論:(1)成功的從人發(fā)提取出角蛋白并制備出HHK海綿。(2)HHK在體外能夠調(diào)節(jié)多種參與神經(jīng)損傷修復(fù)細(xì)胞的生物活性。(3)HHK海綿在體內(nèi)加速了損傷后軸突的再生,為軸突和靶器官的連接爭取了寶貴的時間。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R745;R318.08
【圖文】：

以及部分消化酶如胃蛋白酶或胰蛋白酶，如圖1.1 所示[92]。需要用特定的溶劑從組織中提取角蛋白來確定其理化性質(zhì)，常用的方法有還原法[93]、氧化法[94]、堿提法[95]、硫化溶解法[96]、離子液體法等[97]。不同的提取方法各有利弊，但主要目的是獲得一種得率高的蛋白質(zhì)。哺乳動物中角蛋白的 MW 范圍在 40-70 kD，根據(jù)等電點(diǎn)（pI）的不同又將角蛋白分成 I 型（酸性或亞家族 A）角蛋白和 II 型（堿性或亞家族 B）角蛋白[98, 99]。天然材料能夠提供細(xì)胞結(jié)合和粘附位點(diǎn)，與合成材料相比既適合細(xì)胞的移植也有利于細(xì)胞的遷移，更易于與周圍組織相容[100, 101]，角蛋白的可塑性很強(qiáng)，用其制備的薄膜、水凝膠、復(fù)合支架等生物材料已被廣泛生產(chǎn)并應(yīng)用于各種生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如骨組織工程、眼再生、傷口愈合、神經(jīng)重建和皮膚替代物等，其中用人發(fā)角蛋白制備的人造血管和人造皮膚，由于其含有與真皮相同的結(jié)構(gòu)與修復(fù)因子，在臨床應(yīng)用中效果顯著且無排斥反應(yīng)[102]，普通的高分子材料很難達(dá)到這一要求。人發(fā)角蛋白的分子量在 41.5-59 kDa 之間，pI 在 5.1-6.8 范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)證明

人發(fā)角蛋白促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷后的神經(jīng)修復(fù)（8） 足印分析、SFI 檢測 SD 大鼠運(yùn)動功能的恢復(fù)（9） 腓腸肌宏觀觀察、腓腸肌濕重、肌纖維橫截面積判斷靶器官的萎縮情況（10） TEM 觀察再生神經(jīng)髓鞘的變化2.4 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線

技術(shù)路線圖

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本文編號：2772390