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ApoE靶向還原敏感納米囊泡載阿霉素治療腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究

發(fā)布時(shí)間：2020-07-27 14:54

【摘要】：腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞系統(tǒng)惡性腫瘤,目前的治療原則是:在手術(shù)治療的基礎(chǔ)上,聯(lián)合放療和化療。膠質(zhì)瘤化療的最大難題就是如何讓藥物穿越血腦屏障(BBB)到達(dá)腫瘤部位發(fā)揮作用�；谛滦秃蛄蛭逶h(huán)的環(huán)狀碳酸酯單體(DTC)和三亞甲基碳酸酯(TMC)的共聚物PEG-P(TMC-DTC)具有良好的生物相容性和還原響應(yīng)性,有望成為一種高效的藥物遞送載體。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)蛋白多肽ApoE能較好地靶向到BBB和膠質(zhì)瘤細(xì)胞共表達(dá)的LRP1受體上,故選擇ApoE作為靶向分子。目前膠質(zhì)瘤的臨床一線用藥為替莫唑胺(TMZ),由于多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)對(duì)TMZ的耐藥性,大多數(shù)GBM患者(60-75%)不能從TMZ治療中獲益,研發(fā)新型藥物用于膠質(zhì)瘤患者的治療迫在眉睫�；谶@一臨床問題,本課題組成功構(gòu)建了一種新型靶向腦膠質(zhì)瘤的囊泡納米載藥體系,并在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其治療膠質(zhì)瘤的療效。結(jié)果表明采用PEG-P(TMC-DTC)兩嵌段聚合物作為納米載體包裹化療藥物阿霉素(DOX)以制備成囊泡納米藥物,可使DOX穿越BBB到達(dá)腫瘤部位進(jìn)行釋放,達(dá)到治療膠質(zhì)瘤的目的。第一部分:生物可降解及還原敏感囊泡納米粒的制備和表征目的:以蛋白多肽ApoE作為靶向分子,以PEG-P(TMC-DTC)作為納米載體,包裹阿霉素DOX制備成穩(wěn)定的具有還原響應(yīng)的囊泡納米粒。方法:首先通過加成反應(yīng)將ApoE分子修飾到PEG-P(TMC-DTC)聚合物上。將ApoE-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)聚合物以10 mg/m L的濃度用DMF溶液溶解好后,將兩種聚合物按適當(dāng)?shù)谋壤稳霗幟仕峋彌_液中(pH 4,10 mM),置于37℃靜置1-2小時(shí)。待囊泡溶液呈均一的泛藍(lán)光狀,用飽和的Na_2HPO_4溶液將囊泡溶液的pH調(diào)至7.8,約3秒后滴入DOX溶液,攪拌5-10min。靜置過夜自交聯(lián),最后于室溫下在PB(pH 7.4,10 mM)中透析6-8小時(shí)。制備好囊泡納米粒后,用DLS儀檢測(cè)納米粒的粒徑、粒徑分布(PDI)和不同條件(稀釋100倍、10%FBS、放置一周)納米粒的穩(wěn)定性以及在10 mM GSH條件下的還原響應(yīng)性。并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)納米粒中DOX的包封效率和載藥量。結(jié)果:本研究構(gòu)建的納米囊泡粒徑約80 nm,且不同ApoE靶向比例對(duì)納米粒的粒徑和粒徑分布沒有明顯影響。載DOX對(duì)不同ApoE靶向比例納米粒(ApoE:0、10、20、30%)的粒徑和粒徑分布的影響不大。在10%的FBS、100倍及200倍稀釋、放置1周的條件下,納米粒ApoE20-PS的粒徑及PDI都沒有發(fā)生太大的變化,提示我們的納米粒相對(duì)穩(wěn)定。在沒有GSH的條件下,納米粒放在搖床中搖晃24h,粒徑及PDI沒有明顯變化;而在10 mM GSH的條件下,12h后納米粒已經(jīng)開始溶脹使粒徑增大,到24h后納米粒完全溶脹,粒徑明顯增大至1000多納米,提示納米粒已經(jīng)發(fā)生響應(yīng)。我們從載藥囊泡納米粒釋放實(shí)驗(yàn)觀察到,在24小時(shí)內(nèi),還原條件下PS-DOX和ApoE-PS-DOX分別釋放了70%和83%,而生理?xiàng)l件下只釋放了16%和21%。結(jié)論:本研究制備了一種具有腦膠質(zhì)瘤靶向前景的囊泡納米藥物ApoE20-PS-DOX,該納米藥物具有很好的穩(wěn)定性和還原響應(yīng)性,而且在還原環(huán)境下DOX能高效釋放。第二部分:生物可降解及還原敏感囊泡納米粒的體外生物活性檢測(cè)目的:對(duì)構(gòu)建的新型囊泡納米粒藥物ApoE20-PS-DOX的體外生物活性進(jìn)行評(píng)價(jià),以檢測(cè)其生物相容性及對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性及靶向性。方法:以MTT法檢測(cè)聚合物濃度在0.1-0.5mg/mL時(shí)PS、ApoE-PS對(duì)U87及正常膠質(zhì)細(xì)胞的毒性,以評(píng)估其生物安全性。以Annexin V-FITC/7AAD法檢測(cè)囊泡納米粒藥物ApoE20-PS-DOX、Lipo-DOX、PS-DOX對(duì)U87細(xì)胞凋亡的影響,并用WB實(shí)驗(yàn)探索相關(guān)的分子機(jī)制。以Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)囊泡納米粒藥物ApoE20-PS-DOX、Lipo-DOX、PS-DOX對(duì)U87細(xì)胞侵襲的影響。以FACS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lipo-DOX、PS-DOX及不同ApoE靶向比例囊泡納米粒藥物ApoE-PS-DOX的內(nèi)吞效果;用CLSM實(shí)驗(yàn)檢測(cè)囊泡納米粒藥物ApoE20-PS-DOX、Lipo-DOX、PS-DOX內(nèi)吞和細(xì)胞內(nèi)釋放情況。結(jié)果:1、在U87細(xì)胞中,納米囊泡藥物ApoE10-PS-DOX、ApoE20-PS-DOX、ApoE30-PS-DOX、PS-DOX、Lipo-DOX的IC50分別為:1.7、1.0、1.8、3.6、10.2μg/ml,ApoE20-PS-DOX能夠引起最顯著的細(xì)胞毒性;2、在納米囊泡藥物ApoE-PS-DOX中,ApoE20-PS-DOX組對(duì)U87細(xì)胞靶向效果最好,其靶向效果是Lipo-DOX 5倍;3、納米囊泡藥物PS-DOX引起約40%細(xì)胞凋亡,ApoE-PS-DOX引起約80%細(xì)胞凋亡,且ApoE20-PS-DOX促凋亡作用最明顯;4、Transwell實(shí)驗(yàn)觀察到ApoE20-PS-DOX組抑制U87細(xì)胞侵襲的作用最為明顯,強(qiáng)于PS-DOX組及Lipo-DOX組。結(jié)論:新型腦靶向囊泡納米藥物ApoE-PS-DOX具有一定的腦膠質(zhì)瘤靶向性,且在ApoE比例為20%時(shí),對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞的靶向效果最佳;該囊泡納米藥物能明顯促進(jìn)U87細(xì)胞凋亡并抑制其侵襲。第三部分:生物可降解及還原敏感囊泡納米粒的體內(nèi)生物活性檢測(cè)目的:對(duì)新型囊泡納米粒藥物ApoE20-PS-DOX的體內(nèi)生物活性進(jìn)行評(píng)價(jià),檢測(cè)囊泡納米藥物DOX的生物分布、血液循環(huán)時(shí)間,探索對(duì)原位腦膠質(zhì)瘤模型的治療效果及機(jī)制。方法:1、血液循環(huán)實(shí)驗(yàn):檢測(cè)不同載藥納米粒注射到荷瘤裸鼠后,在血液中的循環(huán)時(shí)間;2、生物分布實(shí)驗(yàn):檢測(cè)不同載藥納米粒注射到荷瘤裸鼠后,不同器官及腫瘤部位DOX·HCl的分布情況;3、藥物耐受量實(shí)驗(yàn):摸索裸鼠對(duì)DOX的耐受情況;4、活體成像實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)治療過程中顱內(nèi)腫瘤變化;5、HE染色評(píng)估腫瘤治療效果和對(duì)心臟毒性;6、Tunel法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)凋亡情況。結(jié)果:1、從血液循環(huán)實(shí)驗(yàn)中:我們觀察到Lipo-DOX的半衰期約為8.2小時(shí),DOX經(jīng)過我們的囊泡納米粒包裹之后循環(huán)時(shí)間由0.2小時(shí)延長至3.9小時(shí);2、從生物分布實(shí)驗(yàn)中:我們觀察到在腦腫瘤部位富集:ApoE20-PS-DOX組是PS-DOX組的4.8倍,體現(xiàn)出ApoE具有很好的靶向效果;3、從活體成像實(shí)驗(yàn)中,我們可以看出治療第12天時(shí)顱內(nèi)腫瘤從大到小依次為:PBS組、Lipo-DOX組、PS-DOX組、ApoE20-PS-DOX組、TMZ組;4、ApoE-PS-DOX組治療效果與TMZ組相當(dāng),裸鼠中位生存期從長到短依次為:TMZ組(51天)、ApoE-PS-DOX組(44天)、無靶向的PS-DOX組(35天)、Lipo-DOX組(28天)、PBS對(duì)照組(23天)。結(jié)論:新型腦膠質(zhì)瘤靶向囊泡納米載體能提升小鼠對(duì)DOX的耐受能力,且具有較長的血液循環(huán)時(shí)間;生物分布實(shí)驗(yàn)顯示相比于PS-DOX組及Lipo組,ApoE-PS-DOX組富集到腦膠質(zhì)瘤部位DOX更多;對(duì)原位腦膠質(zhì)瘤有較好的治療效果,而且能降低DOX對(duì)心臟的毒副作用。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.41
【圖文】：

滯留效應(yīng),實(shí)體瘤,腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞,腦膠質(zhì)瘤

在穿越BBB后又能選擇性靶向腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)DOX藥物在腦膠質(zhì)瘤的高效選擇性富集。圖1： Enhanced Permeability and Retention 實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)）引自 Quantitative imaging in medicine and surgery, 2012, 2(2): 106.

受體,配體