【摘要】：研究背景與目的神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma NB)是兒童中一種最常見的惡性實(shí)體性腫瘤疾病,其發(fā)病率在兒童腫瘤中約占10%左右,此病的危害性僅次于白血病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,預(yù)后效果較差。神經(jīng)母細(xì)胞瘤為一種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤,它起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)嵴祖細(xì)胞,好發(fā)生于腎上腺、頸部、胸部、腹部等神經(jīng)組織。大量臨床研究證實(shí),神經(jīng)母細(xì)胞瘤具有惡性程度高、異質(zhì)性高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、預(yù)后差等多種臨床特點(diǎn)。目前,醫(yī)學(xué)針對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床治療方案有限、效果不佳,除少數(shù)患者可自行緩解或進(jìn)行腫瘤早期完全切除以外,大多數(shù)患者還存在預(yù)后較差,五年生存率低于40%的問題。分子生物學(xué)試驗(yàn)顯示,體內(nèi)多種基因的異常表達(dá)與兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤的分級、治療和預(yù)后具有密切聯(lián)系,如MYCN異常表達(dá)、抑癌基因序列l(wèi)p36.1及l(fā)p36.2缺失等。目前,人們對于神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的詳細(xì)分子機(jī)制尚不明確。因此,研究神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)病的分子機(jī)制,篩選調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖與分化的關(guān)鍵靶點(diǎn),闡明其調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖與分化的作用機(jī)理,可以為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床診斷和治療提供新策略及新型方法,具有較大臨床意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度在18-22 nt的非編碼小RNA分子,能夠與特定mRNA的3-UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合,從而抑制mRNA的翻譯,調(diào)控基因蛋白水平的表達(dá)。研究表明,miRNA分子廣泛參與著細(xì)胞內(nèi)的各種生理病理過程,且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。例如,miR-23a能夠同時抑制st71表達(dá)且促進(jìn)IKKα的表達(dá),這種調(diào)控下進(jìn)一步促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程;Zhao L等研究發(fā)現(xiàn),miR-490可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,且研究證明miR-490具有抑癌基因的功能。YuB等研究表明,miR-148a通過STAT和AKT信號通路靶向調(diào)控CCK-BR的表達(dá),從而抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。大量證據(jù)顯示,miRNA在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中也存在表達(dá)異�，F(xiàn)象,多種miRNA分子參與調(diào)控了神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程,這表明miRNA在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮著重要作用。miR-25是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)miRNA分子之一,屬于miR-106b-25家族,位于人第7號染色體,在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào),在腫瘤的發(fā)展過程中起著重要的調(diào)控作用。Petrocca等研究發(fā)現(xiàn)miR-106b-25簇(miR-106b、miR-25、miR-93)在胃癌細(xì)胞中高表達(dá),其表達(dá)受E2F1調(diào)節(jié)因子的調(diào)控,同時,miR-106b和miR-93又能調(diào)節(jié)E2F1的表達(dá),因此形成了一個負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路。在非小細(xì)胞肺癌中,miR-25表達(dá)上調(diào),且通過靶向FBXW7基因促進(jìn)腫瘤的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移,具有癌基因的功能;miR-25參與調(diào)節(jié)多個靶基因,但其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的功能及調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。因此,在上述研究基礎(chǔ)上,本文旨在探討并明確miR-25在神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)理。本文將分為三個部分進(jìn)行研究,首先通過qRT-PCR方法從基因水平上驗(yàn)證miR-25在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本及細(xì)胞中的表達(dá)情況,其次進(jìn)一步從細(xì)胞水平驗(yàn)證miR-25對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移的影響,最后通過計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測及分子生物學(xué)試驗(yàn)探索miR-25在神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)揮作用的機(jī)制。總之,本試驗(yàn)為深入了解miRNA在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的功能及分子機(jī)制奠定了理論依據(jù)及技術(shù)支持。本論文的主要試驗(yàn)框架及研究內(nèi)容如下圖所示:研究方法1.第一部分:miR-25在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本及細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義:首先收集34例患有小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤病的腫瘤組織,同時對收集的組織標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)信息的記錄,采集的病料標(biāo)本首先在液氮環(huán)境中進(jìn)行迅速冰凍,隨后立即將標(biāo)本儲存于-70 ℃冰箱中備用。迅速復(fù)蘇購買的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株,并用10%的胎牛血清對復(fù)蘇后的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)后再分別利用RNA提取試劑盒進(jìn)行組織及細(xì)胞總RNA的提取,并反轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA備用,最后試驗(yàn)采用qRT-PCR方法檢測miR-25在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織及細(xì)胞中的基因表達(dá)水平。2.第二部分:miR-25對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響:首先人工合成miR-25 mimics及miR-25 inhibitors,用綠色熒光蛋白進(jìn)行標(biāo)記;其次利用LipolifectmianrM2000將上述合成的樣品轉(zhuǎn)染至神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y和IMR32細(xì)胞株中,隨后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染率的檢測;本試驗(yàn)利用CCK-8試驗(yàn)檢測miR-25 mimics 及 miR-25 inhibitors 對細(xì)胞株 SH-SY5Y 和 IMR32 增值能力的影響;流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)檢測miR-25 mimics及miR-25 inhibitors對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期活性的影響;Transwell試驗(yàn)檢測miR-25 mimics及miR-25 inhibitors對細(xì)胞株SH-SY5Y和IMR32侵襲及遷移能力的影響。本試驗(yàn)主要的目的是明確miR-25 mimics及miR-25 inhibitors對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為的影響。3.第三部分:miR-25靶基因TOB1的篩選及鑒定:首先利用生物信息學(xué)軟件對miR-25相關(guān)靶基因進(jìn)行篩選;隨后人工構(gòu)建篩選的靶基因的野生型和突變性熒光素酶報告質(zhì)粒,將構(gòu)建的質(zhì)粒及對照空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中,鑒定熒光素酶活性并進(jìn)行miR-25靶基因的初步判斷;最后細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-25 mimics 及 miR-25 inhibitors,分別在基因及蛋白水 平上檢測預(yù)測靶基因mRNA及蛋白表達(dá)變化水平,以達(dá)到通過雙向分析方法驗(yàn)證miR-25對靶基因的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果1.相比較于低危組神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織,高危組標(biāo)本中miR-25的表達(dá)量顯著增加,且miR-25的表達(dá)量與腫瘤分期呈正相關(guān)性,即分期越高miR-25的表達(dá)量越多(P0.05)。相比較于原發(fā)瘤細(xì)胞,轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞中miR-25的表達(dá)量明顯增高(P0.05)。2.利用熒光顯微鏡對miR-25 mimics和miR-25 inhibitors轉(zhuǎn)染至細(xì)胞株SH-SY5Y和IMR32的成功效率進(jìn)行檢測。CCK-8試驗(yàn)檢測細(xì)胞增值率結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-25的高表達(dá)顯著促進(jìn)了神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增值能力,其中與陰性對照組相比,在miR-25 mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞株IMR32之后的48-72 h內(nèi)細(xì)胞OD值顯著升高(P0.05),而下調(diào)miR-25的表達(dá)可抑制細(xì)胞株SH-SY5Y的細(xì)胞增殖能力。Transwell試驗(yàn)檢測miR-25對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲及遷移能力,研究結(jié)果顯示,miR-25可以顯著增強(qiáng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y和IMR32的遷移及侵襲能力。與對照組相比較,上調(diào)miR-25的表達(dá)之后我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移至下孔的數(shù)量增加,這表明神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力顯著提高(P0.05),此外,下調(diào)miR-25的表達(dá)后顯示神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯受到抑制(P0.05)。流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)分析腫瘤細(xì)胞在不同分期的細(xì)胞數(shù)量結(jié)果顯示,與對照組相比較,上調(diào)miR-25的表達(dá)可以使細(xì)胞株IMR32在S期的細(xì)胞數(shù)明顯增加,而在G1期時細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P0.05),下調(diào)miR-25的表達(dá)后,可以使細(xì)胞株SH-SY5Y在G1期時細(xì)胞數(shù)量增多,而在S期的細(xì)胞數(shù)目顯著減少,這表明腫瘤細(xì)胞的增值能力受到影響且凋亡數(shù)量增加(P0.05)。因此我們猜想miR-25起作用的時期可能是在細(xì)胞尚未進(jìn)行有絲分裂到即將要開始進(jìn)行有絲分裂的過程中。3.利用靶基因預(yù)測軟件我們初步篩選出TOB1為miR-25的的潛在靶基因。雙熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-25可以與TOB1的3‘UTR結(jié)合,在進(jìn)行共轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)TOB1的表達(dá)量降低。為了在基因水平上進(jìn)一步證實(shí)miR-25對TOB1 mRNA的影響,qRT-PCR試驗(yàn)顯示上調(diào)miR-25可以顯著降低TOB1 mRNA的表達(dá)量(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示上調(diào)miR-25的表達(dá)后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中TOB1的表達(dá)量受到抑制(P0.05),而在低表達(dá)miR-25后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中TOB1的表達(dá)量增加(P0.05)。研究結(jié)論1.惡性神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本及細(xì)胞中miR-25的表達(dá)量顯著高于低危性神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織及細(xì)胞,因此miR-25可以作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤高低危性診斷及預(yù)后判斷的一個重要性指標(biāo)。2.上調(diào)miR-25的表達(dá)可以使神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力顯著增強(qiáng),而抑制miR-25的表達(dá)可以呈現(xiàn)相反的結(jié)果。此外,miR-25在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞G1-S期起到明顯的干擾作用。因此miR-25在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮癌基因的作用。3.miR-25可以與TOB1的3'UTR靶向結(jié)合,且可以控制TOB1基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯,為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4
【圖文】：

１邐ｍｉＲ－２５對神經(jīng)母細(xì)胞痛增殖能力的影響逡逑為了深入探宄ｍｉＲ－２５在神經(jīng)母瘤細(xì)胞中的作用，本試驗(yàn)選擇ＳＨ－ＳＹ５Ｙ和逡逑ＩＭＲ３２細(xì)胞采用ＣＣＫ－８方法進(jìn)行體外研[偂Ｊ匝榻峁繽跡彼荊赴懼義希恚椋遙玻靛澹椋睿瑁椋猓椋簦錚蠔�，神经内s赴魷赴櫻齲櫻伲擔(dān)俚腦鮒乘俁讓饗韻碌鰨醫(yī)弦蹂義閑遠(yuǎn)哉兆楸澩锪懇蠶陸擔(dān)礱饗碌鰨恚椋遙玻的芄灰種粕窬趕赴魷赴櫻齲義希櫻伲擔(dān)俚腦鮒常ㄍ跡保粒冢桑停遙常蠶赴泄澩錚恚椋遙玻島�，其怎V乘俁讓麇義舷約涌

本文編號：2771869