【摘要】：目的:探討托法替尼(tofacitinib)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)大鼠的防治作用及其免疫學(xué)機(jī)制,為托法替尼治療多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)尋找理論依據(jù)。方法:選擇50只Wistar雌性大鼠,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、EAE對(duì)照組、托法替尼小、中、大劑量防治組,每組10只,采用髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)及完全弗氏佐劑制(complete freud's adjuvant,CFA)注入EAE對(duì)照組及托法替尼大、中、小劑量防治組大鼠雙側(cè)后肢足掌皮下(0.2ml/100g)造EAE模型,正常對(duì)照組給予等量生理鹽水+CFA,造模后當(dāng)天及第2日,分別給各組大鼠腹腔注射百日咳素(pertussis toxin,PTX)(0.2ml/只)加強(qiáng)免疫反應(yīng)。從造模前3天開始,小、中、大劑量托法替尼防治組分別予以生理鹽水和托法替尼1、2、4 mg/(kg·d)(2ml注射用生理鹽水溶解)灌胃,EAE對(duì)照組和正常對(duì)照組均灌胃等量生理鹽水,連續(xù)10天。將連續(xù)3天癥狀評(píng)分無(wú)加重、四肢癱瘓或死亡作為各組大鼠發(fā)病高峰期,在發(fā)病高峰期處死大鼠,未發(fā)病大鼠觀察8周后處死。保留大鼠下腔靜脈血、腦組織及脾臟。觀察大鼠發(fā)病情況(發(fā)病潛伏期、進(jìn)展期及高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分變化);觀察各組發(fā)病大鼠腦組織基本病理改變;通過(guò)免疫組織化學(xué)法,采用抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體(GFAP)檢測(cè)各組大鼠腦組織內(nèi)的星型膠質(zhì)細(xì)胞活化情況,用髓鞘堿性蛋白(MBP)抗體染色標(biāo)記各組大鼠腦白質(zhì)內(nèi)的髓鞘,觀察其脫失情況;流氏細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠脾脾組織中Tfh(CD4+CXCR5+ICOS+T細(xì)胞群)比例和Tfr(CD4+Foxp3+CXCR5+ICOS+T細(xì)胞群)比例、Tfr/Tfh比值變化;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測(cè)大鼠腦組織勻漿中CXCL13、TGF-β1含量變化;ELISA法檢測(cè)外周血IL-10、IL-21含量變化;7、將EAE對(duì)照組及托法替尼各劑量防治組發(fā)病高峰期臨床表現(xiàn)與發(fā)病高峰期免疫學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果:(1)臨床表現(xiàn):正常對(duì)照組大鼠未發(fā)病,EAE對(duì)照組全部發(fā)病,小、中、大劑量托法替尼防治組大鼠發(fā)病率分別是90%、60%、40%。發(fā)病大鼠多于造模后第10-12天開始出現(xiàn)精神萎靡,體重減輕,活動(dòng)及食量減少等,此后病情逐漸加重,于造模后第15-20天達(dá)疾病高峰:表現(xiàn)為極度衰弱消瘦、單后肢或雙后肢無(wú)力拖地、共濟(jì)失調(diào)、癱瘓甚至死亡。①潛伏期:托法替尼各防治組發(fā)病潛伏期均較EAE對(duì)照組延長(zhǎng),劑量越大,潛伏期延長(zhǎng)越明顯,中、大劑量托法替尼防治組發(fā)病潛伏期較小劑量托法替尼防治組延長(zhǎng),大劑量托法替尼防治組發(fā)病潛伏期較中劑量托法替尼防治組延長(zhǎng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);②進(jìn)展期:托法替尼各防治組發(fā)病進(jìn)展期均較EAE對(duì)照組縮短,中、大劑量托法替尼防治組發(fā)病進(jìn)展期較小劑量托法替尼防治組縮短,大劑量托法替尼防治組發(fā)病進(jìn)展期較中劑量托法替尼防治組縮短,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。③高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分:托法替尼各防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分均較EAE對(duì)照組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),中、大劑量托法替尼防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分較小劑量托法替尼防治組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01、P0.05),大劑量托法替尼防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分較中劑量托法替尼防治組低,但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)腦組織病理改變:正常對(duì)照組大鼠腦組織無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);EAE對(duì)照組及托法替尼各劑量防治組大鼠腦組織內(nèi)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞環(huán)繞血管周圍。但與EAE對(duì)照組比較,托法替尼各劑量組大鼠腦組織病理評(píng)分均下降,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);且以大劑量托法替尼組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕最明顯,各劑量組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01、P0.05)。(3)腦組織免疫組化結(jié)果(1)星型膠質(zhì)細(xì)胞活化情況:正常對(duì)照組大鼠腦組織內(nèi)未見(jiàn)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá);EAE對(duì)照組大鼠腦組織內(nèi)彌漫分布活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞;與EAE對(duì)照組相比,托法替尼各劑量組腦組織GFAP陽(yáng)性細(xì)胞平均IOD值顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與托法替尼小劑量組比較,托法替尼大、中劑量組腦組織GFAP陽(yáng)性細(xì)胞平均IOD值明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與托法替尼中劑量組比較,托法替尼大劑量組腦組織GFAP陽(yáng)性細(xì)胞平均IOD值顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(2)髓鞘脫失變化:正常對(duì)照組大鼠腦組織內(nèi)未見(jiàn)明顯髓鞘脫失,而EAE對(duì)照組、托法替尼各劑量防治組腦組織中髓鞘脫失明顯,MBP染色陽(yáng)性表達(dá)IOD值較正常對(duì)照組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);托法替尼各劑量防治組腦組織MBP染色陽(yáng)性表達(dá)IOD值較EAE對(duì)照組皆顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與托法替尼小劑量防治組相比,托法替尼大、中劑量防治組腦組織MBP陽(yáng)性表達(dá)IOD值顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與托法替尼中劑量防治組相比,托法替尼大劑量防治組腦組織MBP陽(yáng)性表達(dá)IOD值明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(4)大鼠脾組織Tfh細(xì)胞比例、Tfr細(xì)胞比例、Tfr/Tfh比值變化:(1)Tfh細(xì)胞比例:與正常對(duì)照組相比,EAE對(duì)照組脾組織Tfh細(xì)胞比例顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),與EAE對(duì)照組相比,托法替尼各劑量防治組大鼠脾組織中Tfh細(xì)胞比例顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與托法替尼小劑量防治組相比,托法替尼大、中劑量防治組大鼠脾組織Tfh細(xì)胞比例顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01、P0.05),與托法替尼中劑量防治組相比,托法替尼大劑量防治組大鼠脾組織Tfh細(xì)胞比例顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(2)Tfr細(xì)胞比例:與正常對(duì)照組相比,EAE對(duì)照組脾組織Tfr細(xì)胞比例顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01、P0.05),與EAE對(duì)照組相比,托法替尼各劑量防治組大鼠脾組織中Tfr細(xì)胞比例顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01、P0.05);與托法替尼小劑量防治組相比,托法替尼大、中劑量防治組大鼠脾組織Tfr細(xì)胞比例顯著上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),與托法替尼中劑量防治組相比,托法替尼大劑量防治組大鼠脾組織Tfr細(xì)胞比例顯著上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)脾組織Tfr/Tfh比值變化:與正常對(duì)照組相比,EAE對(duì)照組脾組織Tfr/Tfh比值顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與EAE對(duì)照組相比,托法替尼各劑量防治組大鼠脾組織中Tfr/Tfh比值顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與托法替尼小劑量防治組比較,托法替尼大、中劑量防治組大鼠脾組織Tfr/Tfh比值顯著上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與托法替尼中劑量防治組相比,托法替尼大劑量防治組大鼠脾組織Tfr/Tfh比值顯著上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)腦組織勻漿中CXCL13、TGF-β1含量變化:(1)CXCL13含量變化:與正常對(duì)照組相比,EAE對(duì)照組、托法替尼各防治組大鼠腦組織勻漿CXCL13水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與EAE對(duì)照組相比,托法替尼各劑量防治組大鼠腦組織勻漿中CXCL13水平均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01、P0.05);與托法替尼小劑量防治組相比,托法替尼大、中劑量防治組腦組織勻漿中的CXCL13水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01、P0.05);與托法替尼中劑量防治組相比,托法替尼大劑量防治組腦組織勻漿中的CXCL13水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)TGF-β1含量變化:與正常對(duì)照組相比,EAE對(duì)照組、托法替尼各劑量防治組大鼠腦組織勻漿TGF-β1水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與EAE對(duì)照組相比,托法替尼各劑量防治組大鼠腦組織勻漿TGF-β1水平均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01、P0.05);與托法替尼,小劑量防治組相比,托法替尼大、中劑量防治組大鼠腦組織勻漿中TGF-β1水平明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與托法替尼,中劑量防治組相比,托法替尼大劑量防治組大鼠腦組織勻漿中TGF-β1水平明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(6)血清中IL-21、IL-10含量變化:(1)IL-21含量變化:與正常對(duì)照組相比,EAE對(duì)照組、托法替尼各劑量防治組大鼠血清中IL-21含量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與EAE對(duì)照組相比,托法替尼各劑量防治組血清中IL-21含量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與托法替尼小劑量防治組比較,托法替尼大、中劑量防治組血清中IL-21含量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與托法替尼中劑量防治組比較,托法替尼大劑量防治組血清中IL-21含量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(2)IL-10含量變化:與正常對(duì)照組相比,EAE對(duì)照組、托法替尼各防治組大鼠血清中IL-10含量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與EAE對(duì)照組相比,托法替尼各劑量防治組血清中IL-10含量顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與托法替尼小劑量防治組相比,托法替尼大、中劑量防治組血清中的IL-10水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與托法替尼中劑量防治組相比,托法替尼大劑量防治組血清中的IL-10水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(7)相關(guān)性分析:(1)EAE對(duì)照組及托法替尼各劑量組大鼠發(fā)病潛伏期與脾組織Tfr細(xì)胞比例、Tfr/Tfh比值、腦組織勻漿中TGF-β1含量及血清IL-10水平的呈正相關(guān)(P0.01);與脾組織Tfh細(xì)胞比例、腦組織勻漿中CXCL13含量及血清IL-21水平呈負(fù)相關(guān)(P0.01)。(2)EAE對(duì)照組及托法替尼各劑量組大鼠發(fā)病進(jìn)展期與脾組織Tfh細(xì)胞比例、腦組織勻漿中CXCL13含量及血清IL-21水平呈正相關(guān)(P0.01);與脾組織Tfr細(xì)胞比例、Tfr/Tfh比值、腦組織勻漿中TGF-β1含量及血清IL-10水平的呈負(fù)相關(guān)(P0.01)。(3)EAE對(duì)照組及托法替尼各劑量組大鼠發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分與脾組織Tfh細(xì)胞比例、腦組織勻漿中CXCL13含量及血清IL-21水平呈正相關(guān)(P0.01);與脾組織Tfr細(xì)胞比例、Tfr/Tfh比值、腦組織勻漿中TGF-β1含量及血清IL-10水平的呈負(fù)相關(guān)(P0.01、P0.05)。結(jié)論:(1)Wistar大鼠通過(guò)注入豚鼠脊髓勻漿可以成功誘導(dǎo)EAE模型,促使EAE大鼠發(fā)病,明顯增加發(fā)病大鼠腦組織內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。(2)EAE大鼠存在Tfh細(xì)胞比例升高、Tfr細(xì)胞比例下降、Tfr/Tfh比值失衡,發(fā)病高峰期CXCL-13及IL-21含量明顯升高、TGF-b1、IL-10含量明顯降低,免疫平衡向Tfh細(xì)胞漂移。(3)托法替尼可延長(zhǎng)EAE大鼠發(fā)病潛伏期、縮短進(jìn)展期、降低神經(jīng)功能障礙評(píng)分,同時(shí)減輕腦組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)、抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞活化及髓鞘脫失的病理?yè)p害,從而對(duì)EAE發(fā)病具有防治作用,且劑量越大,防治作用越明顯。(4)托法替尼對(duì)EAE大鼠發(fā)病的防治作用機(jī)制可能與下調(diào)EAE大鼠Tfh細(xì)胞比例及CXCL-13、IL-21的表達(dá)、上調(diào)Tfr細(xì)胞比例及TGF-b1、IL-10的表達(dá)、維持Tfr/Tfh平衡并促使平衡向Tfr偏移有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R744.51
【圖文】：

comparison (day)1.2 EAE 對(duì)照組及托法替尼各防治組大鼠病潛伏期、進(jìn)展期和高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分比較（見(jiàn)表2 ，圖1.1-1.3 ）

圖1.2：EAE對(duì)照組及托法替尼各防治組發(fā)病進(jìn)展期比較（天）re1.2: EAE control group and tofacitinib treatment group the incidadvanced comparison (day)EAE 對(duì)照組及托法替尼各防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)e1.3: EAE control group and tofacitinib treatment group peak incid

EAE 對(duì)照組及托法替尼各防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)1.3: EAE control group and tofacitinib treatment group peak incidneurological dysfunction score (point)示：托法替尼各防治組發(fā)病潛伏期均較 EAE 對(duì)照組替尼防治組發(fā)病潛伏期較小劑量托法替尼防治組延治組發(fā)病潛伏期較中劑量托法替尼防治組延長(zhǎng)，差<0.01）；托法替尼各防治組發(fā)病進(jìn)展期均較 EAE 對(duì)托法替尼防治組發(fā)病進(jìn)展期較小劑量托法替尼防治尼防治組發(fā)病進(jìn)展期較中劑量托法替尼防治組縮短（P<0.01）。托法替尼各防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功

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9 穆小亮;基于帕累托法的集裝箱班輪船期恢復(fù)模型研究[D];大連海事大學(xué);2014年

10 劉旭平;U型船尾安裝船運(yùn)動(dòng)特性及極限強(qiáng)度研究[D];天津大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2768680