【摘要】：第一部分消退素D1對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的影響目的:研究消退素D1(Resolvin D1,RvD1)能否促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬發(fā)生,以及對(duì)自噬流的影響。方法:以小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2為研究對(duì)象,實(shí)驗(yàn)共分為A、B和C三部分。A部分研究RvD1促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的最佳濃度,實(shí)驗(yàn)分為四組:(1)對(duì)照組;(2)RvD1(10 nM)組;(3)RvD1(50 nM)組;(4)RvD1(100 nM)組。2h后提取總蛋白,使用western blotting技術(shù)檢測(cè)自噬的標(biāo)記物L(fēng)C3的表達(dá)水平。B部分研究RvD1促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的最佳時(shí)間,實(shí)驗(yàn)共分為兩批。第一批為早期階段:(1)對(duì)照組;(2)15min組:RvD1(50 nM)刺激細(xì)胞15min;(3)30min組:RvD1(50 nM)刺激細(xì)胞30min。使用western blotting技術(shù)檢測(cè)影響自噬啟動(dòng)的上游指標(biāo)ULK1、BECN1和P62的表達(dá)。第二批為晚期階段:(1)對(duì)照組;(2)1h組:RvD1(50 nM)刺激細(xì)胞1h;(3)2h組:RvD1(50 nM)刺激細(xì)胞2h。使用western blotting技術(shù)檢測(cè)自噬標(biāo)記物P62和LC3的蛋白水平。C部分研究RvD1對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬流的影響,因而本實(shí)驗(yàn)中使用PI3K抑制劑LY294002(LY)抑制自噬早期階段,使用氯喹(CQ)抑制自噬小體與溶酶體融合來抑制自噬晚期階段,實(shí)驗(yàn)共分為四組:(1)對(duì)照組;(2)RvD1(50 nM)組;(3)CQ(20μM)+RvD1組;(4)LY(10μM)+RvD1組。其中CQ于RvD1前22h給藥,LY于RvD1前2h給藥,在RvD1刺激細(xì)胞2h后提取總蛋白,使用western blotting技術(shù)檢測(cè)P62和LC3的蛋白水平,并使用透射電鏡和熒光共聚焦顯微鏡觀察小膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)自噬體的形成。結(jié)果:A部分結(jié)果顯示,和對(duì)照組比較,10 nM、50 nM和100nM的RvD1可不同程度地促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞LC3-II/LC-I的比值增加,而50 nM濃度時(shí)該作用更為顯著。B部分結(jié)果顯示,和對(duì)照組比較,RvD1刺激早期(15min和30min),影響自噬啟動(dòng)的上游指標(biāo)ULK1、BECN1和P62的表達(dá)均無顯著變化,而在刺激晚期(1h和2h),LC3-II/LC-I比值顯著升高,P62的降解顯著增加,其中2h時(shí)該作用更為顯著。C部分結(jié)果顯示,和對(duì)照組相比,RvD1組的LC3-II/LC-I比值顯著增加,P62蛋白水平顯著下降;和RvD1組相比,LY+RvD1組的LC3-II/LC-I比值和P62的表達(dá)水平均無顯著變化,但CQ+RvD1組的LC3-II/LC-I比值進(jìn)一步升高。通過透射電鏡可觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)自噬小體和自噬溶酶體的生成,熒光共聚焦顯微鏡也觀察到自噬的激活。結(jié)論:RvD1可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的發(fā)生,其促進(jìn)自噬的最佳濃度為50 nM,最佳時(shí)間為刺激后2h;RvD1可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬小體的生成及自噬小體與溶酶體的融合。第二部分消退素D1激活小膠質(zhì)細(xì)胞自噬與mTOR通路的關(guān)系目的:研究RvD1激活小膠質(zhì)細(xì)胞自噬是否通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路。方法:以小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2為研究對(duì)象,實(shí)驗(yàn)共分為A、B和C三部分。A部分研究RvD1對(duì)mTOR通路的影響,實(shí)驗(yàn)共分為兩批。第一批為早期階段:(1)對(duì)照組;(2)15min組:RvD1(50 n M)刺激細(xì)胞15min;(3)30min組:RvD1(50 n M)刺激細(xì)胞30min。第二批為晚期階段:(1)對(duì)照組;(2)2h組:RvD1(50 n M)刺激細(xì)胞2h;(3)4h組:RvD1(50 n M)刺激細(xì)胞4h;(4)6h組:RvD1(50 n M)刺激細(xì)胞6h。使用western blotting技術(shù)檢測(cè)mTOR、P-mTOR及其底物ULK1、P-ULK1、4E-BP1、P-4E-BP1、S6K和P-S6K的表達(dá)水平。B部分研究RvD1激活小膠質(zhì)細(xì)胞自噬是否依賴mTOR通路,本實(shí)驗(yàn)中使用了mTOR的抑制劑雷帕霉素(Rapa)和激動(dòng)劑3BDO作為對(duì)照,實(shí)驗(yàn)共分為四組:(1)對(duì)照組;(2)RvD1(50 n M)組;(3)Rapa(50n M)組;(4)3BDO(50μM)組。在刺激細(xì)胞6h后提取總蛋白,使用western blotting技術(shù)檢測(cè)P62、LC3及mTOR的底物P-ULK1、ULK1、P-4E-BP1、4E-BP1、P-S6K、S6K的表達(dá)。C部分研究RvD1激活小膠質(zhì)細(xì)胞自噬是否通過調(diào)控胞內(nèi)Ca~(2+)水平,本實(shí)驗(yàn)中使用花生四烯酸(AA)誘導(dǎo)細(xì)胞胞內(nèi)Ca~(2+)水平升高和CAMK2磷酸化,實(shí)驗(yàn)共分為四組:(1)對(duì)照組;(2)AA(50μM)組;(3)RvD1(50n M)組;(4)AA+RvD1組。預(yù)先用AA或等體積溶劑刺激細(xì)胞2h,再給予RvD1或等體積溶劑繼續(xù)培養(yǎng)2h,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)的水平,并使用western blotting檢測(cè)P-CAMK2和CAMK2的表達(dá)。結(jié)果:A部分結(jié)果顯示,和對(duì)照組相比,RvD1在刺激細(xì)胞早期(15min和30min)對(duì)mTOR及其底物ULK1、4E-BP1、S6K的表達(dá)均無顯著影響,而在刺激細(xì)胞晚期(2h、4h和6h),RvD1可增強(qiáng)mTOR及其底物ULK1、4E-BP1、S6K的磷酸化水平,其中6h時(shí)該作用更為顯著。B部分結(jié)果顯示,和對(duì)照組相比,RvD1組LC3-II/LC-I比值顯著升高,ULK1、4E-BP1和S6K的磷酸化水平也顯著升高,Rapa組LC3-II/LC-I比值顯著升高,P62表達(dá)顯著降低,ULK1、4E-BP1、S6K的磷酸化水平顯著降低,而3BDO組與Rapa組的作用相反。C部分結(jié)果顯示,和對(duì)照組相比,單獨(dú)給予RvD1不影響細(xì)胞胞內(nèi)Ca~(2+)水平和P-CAMK2、CAMK2的表達(dá),AA刺激細(xì)胞后胞內(nèi)Ca~(2+)水平和CAMK2的磷酸化均顯著增加。和AA組比較,AA+RvD1組的胞內(nèi)Ca~(2+)水平和P-CAMK2水平均顯著下降。結(jié)論:RvD1在刺激小膠質(zhì)細(xì)胞晚期可激活mTOR通路;RvD1激活小膠質(zhì)細(xì)胞自噬不依賴mTOR通路。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R741
【圖文】：

科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 結(jié)果D1 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的影響前期實(shí)驗(yàn)，RvD1 能夠在 10nM 和 100nM 的濃度，因此，為了研究 RvD1 能否促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞自00nM 三種濃度的 RvD1 來進(jìn)行研究。將含等體的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞 2h，然后收集總蛋白，使用 LC3-II/LC3-I 比值的變化。

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文D1 刺激早期對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬上游指標(biāo)的影響了進(jìn)一步研究 RvD1 激活小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的最佳處理時(shí)間，我們使用 5 培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞 15min 和 30min，然后收集總蛋白，使用 western blotti響自噬啟動(dòng)的上游指標(biāo) ULK1、BECN1 和 P62 的變化。

圖 1-3 RvD1（50nM）刺激晚期對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞 LC3 和 P62 的影響。** P＜0.01，與 Veh 組比較果顯示（見圖 1-3），和對(duì)照組相比，RvD1 刺激小膠質(zhì)細(xì)胞 1h 和 2h 時(shí)-II/LC3-I 比值并促進(jìn) P62 降解（P＜0.01），而刺激 2h 時(shí)該作用更為顯vD1 刺激小膠質(zhì)細(xì)胞晚期（1h、2h）能明顯激發(fā)自噬，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)間點(diǎn)進(jìn)行研究。1 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬流的影響D1 能夠明顯激活小膠質(zhì)細(xì)胞自噬，但是其對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬流的影響此，我們使用氯喹（CQ）抑制自噬小體和溶酶體的融合來抑制自噬的及 PI3K 抑制劑 LY294002（LY）來抑制自噬的早期階段，進(jìn)一步研質(zhì)細(xì)胞 LC3-II/LC3-I 比值和 P62 表達(dá)的影響。

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本文編號(hào)：2767809